Thành phần dung dịch chiết tách DNA
Thành phần Nồng độ dung dịch mẹ Nồng độ dung dịch làm việc Hỗn hợp 10ml dung dịch chiết tách Tris-HCl(pH=8.0) 1M 50mM 0.5ml EDTA(pH=8.0) 0.5M 0.25mM 0.5ml NaCl 5M 300mM 0.6ml SDS 10% 1% 1.0ml H2O 7.4ml Thành phần dung dịch đệm TE Thành phần Nồng độ dung dịch gốc Nồng độ dung dịch làm việc Hỗn hợp 50ml dung dịch chiết tách Tris-HCl(pH=8.0) 1M 50mM 0.5ml EDTA(pH=8.0) 0.5M 1mM 0.1ml H2O 49.4ml 2.2.7. Phản ứng PCR phát hiện gen kháng bệnh bạc lá
Chỉ thi phát hiện gen Xa4, xa5, Xa7 và Xa21
Chỉ thị NS T Trình tự mồi RE Gen liên kết K. cách (cM) Tài liệu tham khảo Npb181 Npb78
11 F 5'- atc gat cga tct tca cga gg -3' R5'- gtg cta taa aag gca ttc ggg -3'
- Xa-4 1.7 Yoshida et
al. 1992 RG556 5 F 5'- tag ctg ctg ccg tgc tgt gc-3'
R 5'- aat att tca gtg tgc atc tc-3'
Dra I xa-5 0 – 1 Mc Couch
et al. 1991
P3 6 F 5'- cag caa ttc act gga gta gtg gtt -3'
R 5'- cat cac ggt cac cgc cat atc gga- 3'
- Xa-7 Taura et al.
2003 pTA818
và pTA248
11 F5’ ata gca act gat tgc ttt gc 3’ R5’ cga tcg gta taa cag caa aac 3’
- Xa- 21
0-1 Ronald et al.
- 39 -
Thành phần sử dụng cho một phản ứng PCR
- Thành phần 20 µl dung dịch phản ứng PCR gồm có: 12.24 µl nước cất, 0.1 µl Taq DNA Polymerase, 2.0 µl 10X buffer, 1.5 µl of 50 mM MgCl2, 0.16 µl of dNTPs 25 mM, 1 µl mỗi mồi, 1 µl DNA nguyên bản .
- PCR của gen Xa4 và Xa 7 được thực hiện theo chu kì nhiệt như sau: 94ºC trong 4 phút, 30 chu kỳ: 94ºC trong 1 phút, 56ºC trong 1 phút, 72º trong 2 phút, và 72 º C trong 8 phút.
- PCR của gen xa5 được thực hiện theo chu kì nhiệt: 94ºC trong 4 phút, 34 chu kỳ: 94ºC trong 1 phút, 55ºC trong 1 phút, 72º trong 1 phút 50 giây, và 72 º C trong 7 phút.
Sau đó, sản phẩm PCR được cắt bằng enzyme DraI. 15µl phản ứng gồm có 10µl sản phẩm PCR, 0,3µl enzyme DraI 10unit/ µl, 1,5µ buffer B, 3,2µl nước. Hỗn hợp được ủở 37ºC trong ít nhất 6 tiếng.
- Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1,5%. Bản gel được nhuộm bằng ethidium bromide, chụp ảnh dưới tia UV.
2.8.8. Phương pháp giải trình tự gen
2.8.8.1. Nuôi cấy vi khuẩn
Phương pháp được tiến hành theo N. Furuya và cộng sự, 2003 (đã mô tảở trên)
2.8.8.2. Chiết tách DNA tổng số của vi khuẩn
- Theo phương pháp của Adachi , 1990 (đã mô tảở trên)
2.8.8.3. Nhân dòng gen avrXa7
1). Cắt DNA genome vi khuẩn Xoo bằng các enzyme cắt giới hạn
- DNA genome của mỗi chủng vi khuẩn sau khi chiết tách được cắt riêng bằng từng RE BamHI và EcoRI , 370C ủ qua đêm.
2). Điện di sản phẩm cắt và thu đoạn DNA đặc trưng cho avrXa7 từ gel
- Chạy điện di sản phẩm cắt trên gel agarose 1% (với mẫu cắt bằng BamHI) và 1,5 % (với mẫu cắt bằng EcoRI): Kích thước bản gel 20 × 18 cm, hiệu điện thế 50V, chạy điện di trong 25 – 36h ởđiều kiện nhiệt độ 4oC, có kèm ADN ladder 1kb. Nhuộm bản gel trong dung dịch Ethilium bromide và kiểm tra kết quả trong buồng chụp UV.
- So sánh các băng điện di với ADN ladder để xác định vị trí các đoạn 4,2 BamHI và 1,3 EcoRI.
- Xác định vị trí của các đoạn 4,2 BamHI và 1,3 EcoRI trong buồng chụp UV, cắt thu phần gel chứa các đoạn trên.
- Sử dụng Kit (Qiagen, Valencia, CA 91355) tinh sạch DNA từ gel.
3). Chèn đoạn DNA mục tiêu vào phagemid vector
- Sau khi xác định được hàm lượng của mẫu DNA thu được, sử dụng TE để pha loãng sao cho nồng độ của DNA tương đương với nồng độ của phagemid vector.
Chèn đoạn DNA mục tiêu vào phagemid vector
Xác định hàm lượng DNA và phagemid vector
- Sử dụng phương pháp so màu quang phổ xác định hàm lượng ADN: đo độ hấp phụ
của DNA ở bước sóng λ = 260 nm bằng máy quang phổ kế. Từđộ hấp phụ tính toán hàm lượng DNA có trong mẫu, với A260 = 1,0 OD tương đương 50 µg/ml ddDNA sợi kép.
Thành phần phản ứng gồm: Vector pBluescript II KS (0,1 µl/ml) 1 µl ADN mục tiêu (0,1 µl/ml) 2 µl 10 mM rATP (pH 7.0) 1 µl 10× Ligase buffer 1 µl T4 DNA ligase (4 U/µl) 0,5 µl Nước cất vô trùng 5,5 µl Tổng thể tích 10 µl
Phản ứng được tiến hành ởđiều kiện nhiệt độ phòng (220C) trong thời gian 2 giờ hoặc
để qua đêm ở nhiệt độ 40C. Ủ tiếp hỗn hợp qua đêm ở nhiệt độ 12 – 140C. 4). Biến nạp vector tái tổ hợp vào vi khuẩn nhận
Vi khuẩn sử dụng làm chủng chủ là E.coli chủng XL1-Blue MRF´.
- Tạo tế bào khả biến: Xử dụng phương pháp xung điện hoặc xử lý hóa chất (CaCl2)
để tạo tế bào khả biến.
- Biến nạp phagemid tái tổ hợp vào tế bào nhận.
5). Chọn lọc vi khuẩn mang phagemid tái tổ hợp
- Sau quá trình biến nạp, vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường LB có bổ sung chất X-gal, kháng sinh ampicillin và IPTG. Vector pBluescript II KS mang gen kháng kháng sinh ampicillin, nên chỉ những vi khuẩn có vector chuyển nạp mới có khả năng sống được trên môi trường có chất kháng sinh ampicilin.
- 41 -
- Mặt khác, vector tái tổ hợp là vector có DNA chèn vào vùng gen lac-z nên làm gen này không hoạt động. Vì vậy, vi khuẩn mang vector không có DNA cài vào sẽ tạo khuẩn lạc màu xanh, còn vi khuẩn mang vector tái tổ hợp sẽ tạo khuẩn lạc màu trắng khi nuôi trên môi trường có chất X-gal.
2.8.8.4. Giải trình tự gen avrXa7
Giải trình tự gen avrXa7 được thực hiện dựa theo phương pháp của Ponciano, năm 2004. Trình tự của gen avrXa7được xác định dựa vào giải trình tự các đoạn 4,2 BamHI và 1,3 EcoRI. Gồm các bước:
1). Giải trình tự hai dầu 5’ và 3’ đoạn 4,2 BamHI
Thực hiện giải trình tự tựđộng sử dụng các mồi đặc trưng kết hợp với mồi của vector
để giải trình tự hai đầu 5’ và 3’ của avrXa7
avr7N primer 5’- AACCCTCCGACGCTTC -3’
p7NR primer 5’-CAGGGGGGCACCCGTCAGTGC -3’
avr7hinc for primer 5’- GCCCAGTTATCTCGCCC -3’
avr7hinc primer 5’- CGATTGATTCTTCTGAT -3’
avr7BamHI primer 5’- GATCCTGGTTACGCGG -3’
Kết hợp với mồi đặc thù của vector
T3 primer 5’- AATTAACCCTCACTAAAGGG -3’
T7 5’- GTAATACGACTCACTATAGGGC -3’
2). Giải trình tự vùng lặp avrXa7
Do vùng trung tâm của gen avrXa7 có 25.5 bản copy của trình tự lặp 102 bp, khó xác
định vị trí gắn mồi giải trình tự, do đó sử dụng phương pháp chèn Transposon vào đoạn 4,2 BamHI để tạo vị trí gắn mồi thực hiện phản ứng giải trình tự. Trong thí nghiệm này chúng tôi sử dụng Transposon là EZ::Tn5TM <KAN-2>. Transposon EZ::Tn5TM <KAN-2> dài 1221 bp, có gen kháng kháng sinh kanamycin, có 1 vị trí cắt của RE BamHI.
Chuẩn bị ADN mục tiêu:
+ Sử dùng Kit (Qiagen, Valencia, CA 91355) chiết tách plasmid tách phagemid tái tổ
hợp từ các vi khuẩn đã chọn lọc.
+ Phagemid mang đoạn 4,2 BamHI sau khi chiết tách được dùng làm ADN mục tiêu
để thực hiện phản ứng chèn Transposon. Phản ứng chèn Transposon
Chuẩn bị hỗn hợp phản ứng chèn Transposon
EZ::Tn5 10X Reaction Buffer 1 µl DNA mục tiêu 2 µg EZ::Tn5 <KAN-2> Transposon 1µl Nước cất vô trùng 5µl EZ::Tn5 Transposase 1 µl Tổng thể tích 10 µl + Ủ hỗn hợp phản ứng ở 37oC trong 2 giờ.
+ Thêm 1 µl EZ::Tn5 10X Stop Solution để dừng phản ứng. Trộn đều và để hỗn hợp ở
70oC trong 10 phút.
Giải trình tự vùng lặp avrXa7
- Biến nạp ADN vào tế bào vi khuẩn: Sử dụng E.coli chủng XL1-Blue MRF´.
- Chọn lọc vi khuẩn mang phagemid chứa đoạn chèn Transposon: Nuôi cấy vi khuẩn sau khi biến nạp trên môi trường LB, bổ sung 50 µg/µl kháng sinh kanamycin. Do Transposon EZ::Tn5TM <KAN-2> có gen kháng kanamycin nên chỉ những vi khuẩn mang phagemid tái tổ hợp có đoạn chèn Transposon mới có thể sống trên môi trường chọn lọc. Giải trình tự vùng lặp
+ Vùng lặp avrXa7 được giải trình tự tự động hai hướng sử dụng cặp mồi đặc trưng cho Transposon là KAN-2 FP-1và KAN-2 RP-1.
KAN-2 FP-1 5’- ACCTACAACAAAGCTCTCATCAACC -3’ KAN-2 RP-1 5’- GCAATGTAACATCAGAGATTTTGAG -3’
+ Lập bản đồ vị trí chèn của Transposon: Do Transposon chèn vào DNA đích một cách ngẫu nhiên phụ thuộc vị trí cắt của Transposase, do đó cần lập bản đồ vị trí chèn của
- 43 -
Transposon với mục đích chọn các dòng thích hợp cho mỗi chủng để giải trình tự. Sau khi chọn được các dòng thích hợp, tiến hành giải trình tự sử dụng cặp mồi vector sau:
5.3.Giải trình tựđoạn 1,3 EcoRI
Trình tự 174 bp bị thiếu khi cắt avrXa7 bằng RE BamHI thu được thông qua giải trình tựđoạn 1,3 EcoRI, sử dụng cặp mồi:
Cterm1: 5’-GGGCCAAACCGTCCCCTACT-3’ 9bRev: 5’-TCGGCAGGGATTCGTGTAA-3’
Trình tự gen avrXa7được xác định dựa vào trình tự của các đoạn đặc trưng được giải trình tựở trên, sử dụng phần mềm ClustalW
2.2.9. Nuôi cấy bao phấn lúa
Lấy mẫu và xử lý mẫu
- Thời gian lấy đòng lúa từ 8-10 giờ sáng. Chọn và lấy đòng lúa sạch bệnh từ thân chính và có khoảng cách từ tai lá đòng đến gối lá đòng là 5-7cm.
- Các đòng lúa lấy vềđược cắt tỉa các lá già, các phiến lá. Đòng lúa được bọc kín trong giấy báo ẩm rồi đặt trong túi nilon và buộc chặt để trong tủ lạnh 70C trong 7 ngày.
Khử trùng mẫu trong buồng cấy
- Khử trùng hoa lúa: Trước khi bóc đòng lúa ra khởi bẹ lá đòng, dùng cồn 700 lau thật kỹ lá đòng. Để vào buồng cấy vô trùng, sau đó mới bóc đòng ra khỏi bẹ lá đòng và cắt thành từng gié. Chọn những gié ở giữa bông, (các hoa ởđây chứa nhiều hạt phấn 1-2 nhân) và các hoa trên gié có màu xanh nhạt hoặc đầu vỏ trấu có màu xanh và chiều dài bao phấn nằm trong khoảng 1/3 -1/2 chiều dài vỏ trấu.
Khử trùng hoa lúa bằng cồn 700 trong 1 phút, dung dịch HgCl2 0.1% trong 30 giây, rồi rửa 3-4 lần bằng nước cất vô trùng.
Cấy bao phấn để tạo callus
Cắt nhẹđuôi hoa lúa, dùng panh kẹp mỏ hạt và gõ nhẹđể bao phấn rơi trực tiếp vào môi trường nuôi cấy hoặc dùng panh nhỏ gắp bao phấn đặt vào môi trường tạo callus đã chuẩn bị
sẵn. Các bao phấn được sắp xếp ngẫu nhiên, mật độ bao phấn trong một bình thí nghiệm phụ
thuộc vào diện tích bình thí nghiệm (thường 30-40 bao phấn trong bình thí nghiệm chứa 20ml môi trường). Đặt mẫu trong buồng tối ở nhiệt độ 250C. Số lượng bao phấn được kiểm tra hàng tuần bắt đầu từ tuần thứ 2 sau nuôi cấy.
Môi trường nuôi cấy.
Môi trường nuôi cấy pha xong được điều chỉnh pH = 5.8 rồi rót vào các lọ, hấp vô trùng ở 1210C trong 20 phút. Các môi trường được sử dụng là N6, He5, MS tổng hợp.
Các chỉ tiêu theo dõi Thời kỳ nuôi cấy bao phấn
Tổng số bao phấn hóa nâu Tỷ lệ hóa nâu (%) =
Tổng số mẫu cấy x 100
Tổng bao phấn tạo callus Tỷ lệ tạo callus (%)=
Tổng số mẫu cấy x100
Giai đoạn tái sinh
Tổng số callus tạo cây Tỷ lệ callus tái sinh (%) =
Tổng số callus cấy x 100 Tổng số cây bạch tạng Tỷ lệ cây bạch tạng (%) = Tổng số cây tạo thành x 100 Tổng số cây xanh Tỷ lệ cây xanh (%) = Tổng số cây tạo thành x 100 Thí nghiệm ngoài vườn
Đểđánh giá khả năng thích nghi của cây in vitro với điều kiện tự nhiên
Tổng cây sống Tỷ lệ cây sống (%) = Tổng cây ra giá thể x 100 Tổng cây chết Tỷ lệ cây chết (%) = Tổng cây ra giá thể x 100
2.2.10. Nuôi cấy phôi lúa gây tạo đột biến invitrro
Phương pháp tạo mô sẹo từ phôi hạt lúa chín
+ Chọn những hạt chắc mẩy, quan sát bằng mắt không thấy dấu vết của nấm bệnh. Hạt lúa khô được bóc vỏ, chọn những hạt tróc vỏ và còn nguyên phôi cho vào lọ nút nhám và khử
trùng theo trình tự sau: 1 phút trong cồn 70%, lắc nhẹ 10 phút trong dung dịch HgCl2 nồng độ
0,1% , tráng lại bằng nước cất vô trùng 5-6 lần, sau đó chuyển hạt lên đĩa petri có trải giấy lọc vô trùng cho thấm khô nước bám quanh hạt .
- 45 -
+ Hạt gạo đã được khử trùng và cấy trên các môi trường MS và N6 cơ bản có bổ sung 2.4D theo các công thức đã được chuẩn bị trước: Dùng pank gắp nhẹ hạt lúa đã được khử
trùng đặt lên môi trường. Sử dụng bình nuôi cấy là bình trụ hình nhỏ có chứa 10ml môi trường. Mỗi bình cấy 4 -5 hạt, khoảng cách giữa các hạt phải đồng đều. Cần lưu ý là mật độ
cấy có ảnh hưởng khá lớn tới kết quả nuôi cấy phôi, nếu cấy với mật độ quá lớn sẽ làm dinh dưỡng trong bình bị thiếu hụt, chất thải nhiều làm ảnh hưởng tới chất lượng callus. Nếu thao tác cấy quá lâu sẽ làm tăng nguy cơ nhiễm mẫu ảnh hưởng tới kết quả nghiên cứu sau này.
+ Sau khi cấy xong, các mẫu sẽđược đưa vào các tủ định ôn tối ở nhiệt độ cố định 270C trong 1 tuần. Sau đó chuyển ra nuôi ở phòng sáng với cường độ 2000 lux, thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày, nhiệt độ từ 25 - 270C. Khoảng 2-3 tuần, khi khối callus hình thành thì tiến hành đáng giá khả năng tạo callus.
Phương pháp xử lí đột biến mô sẹo lúa bằng chiếu xạ tia gamma từ Co60
Sau khi callus 3 tuần tuổi, lúc này callus đạt được màu sắc và kích thước đẹp, ổn định và khả năng sống, chống chịu cao (Scowcroft et al.1985). Ta tiến hành chọn các callus đẹp (kích thước đồng đều và màu vàng sáng, xốp) cấy lên môi trường nhân callus (MS + 3% Saccharoza + 0,8% agaroza + 1mg/l 2.4 D).
Chú ý: Khi ta cấy chuyển lên môi trường nhân callus thì giữ nguyên vẹn callus không
được tách nhỏ cũng như cắt bỏ phần thừa để tránh gây tổn thương callus trước khi đi xử lý phóng xạ.
Các bình đựng callus được xếp trong thùng lạnh để đem callus đi xử lý phóng xạ. Callus được chiếu xạ từ nguồn Co60 với các liều lượng, 1 Krad, 3 Krad, 5 Krad, 7Krad. Mẫu
được chiếu xạ tại Trung tâm chiếu xạ Quốc gia - Xã Minh Khai - Từ Liêm – Hà Nội.
Sau khi chiếu xạ 1 tuần ta tiến hành đánh giá khả năng sống sót của các callus sau khi chiếu xạở các liều lượng khác nhau. Sau đó những callus sống sót ta tiến hành tách khối nhỏ khoảng 2 – 3 mm và tiếp tục cấy lên môi trường nhân callus.
Phương pháp chiết tách dung dịch vi khuẩn của vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae
• Nguồn vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzae
Sử dụng 2 nhóm chủng vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. Oryzae gây bệnh bạc lá chủng 2 và 3 rất phổ biến và tồn tại ở hầu hết các vùng trồng lúa ở Miền Bắc Việt Nam, do KS.Tống Văn Hải (Bộ môn CNSH- Trường ĐHNN Hà Nội ) cung cấp.
Vi khuẩn được dự trữ và bảo quản trong môi trường sữa milk ở -300C được cấy truyền sang môi trường Wakimoto ở nhiệt độ, 280C.
• Cách chiết tách dung dịch vi khuấn Xanthomonas Oryzae:
Sau khi nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường Wakimoto ở nhiệt độ, 280C, PH=7, 48h tuổi, lấy 3 vòng que cấy vi khuẩn cho vào 10ml nước cất vô trùng, dùng que cấy đánh tan, sau
đó chuyển sang ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút và lọc bằng màng lọc vi khuẩn có
đường kính 0.22 µm. Các bước tiến hành :
- Bước 1: Nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường Wakimoto trong 48h.
- Bước 2: Pha loãng vi khuẩn bằng nước cất vô trùng và đánh tan (lấy khoảng 3 vòng que cấy vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. oryzaecho vào 10ml nước cất vô trùng).
- Bước 3: Đem dung dịch đi ly tâm với tốc độ 13000 vòng/phút trong 10 phút. Sau li tâm hút lấy phần dịch trong và bỏ phần cặn.