- Huyện Yên Lạc- tỉnh Vĩnh Phúc
- Viện khoa học sự sống- Đại học Thái Nguyên, Viện thú y Quốc gia.
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp điều tra
Điều tra bệnh thương hàn ở gà theo phương pháp thu thập số liệu và điều tra dịch tễ học, thống kê số lượng gà mắc bệnh bằng cách lập sổ thống kê...theo phương pháp điều tra nghiên cứu của Nguyễn Văn Thiện và cs (2002)[35].
2.3.2. Phương pháp lấy mẫu
- Mẫu bệnh phẩm là phân gà: phân gà nghi mắc bệnh thương hàn được lấy bằng tăm bông (đã vô trùng), đưa đầu tăm bông vào lỗ huyệt, xoáy đều tăm bông và kéo ra. Phân bám dính vào tăm bông được cho vào nuôi cấy trong môi trường nước thịt.
- Mẫu bệnh phẩm là gan, lách, manh tràng được lấy từ gà nghi mắc bệnh phải được bảo quản lạnh và chuyển tới phòng thí nghiệm.
- Phân gà và chất độn chuồng được lấy ở 5 vị trí khác nhau (4 góc chuồng và ở giữa) trong chuồng nuôi.
Các mẫu phải ghi rõ số liệu, bảo quản lạnh và chuyển tới phòng thí nghiệm nghiên cứu Bộ môn Công nghệ vi sinh - Viện khoa học sự sống- Đại học Thái nguyên.
2.3.3. Phương pháp nuôi cấy, phân lập vi khuẩn Salmonella spp
Sơ đồ 3.1. Quy trình phân lập và giám định vi khuẩn Salmonella từ các mẫu bệnh phẩm
Bệnh phẩm (Phân, gan, lách, hạch ruột, dịch ruột)
BPW (370C/ 18- 24 h) LIM (370C/ 20- 24 h) Malonate (370C/ 18- 24 h) TSI (370C/ 18- 24 h) Xác định serotyp Giữ giống RV (420C/ 18- 24 h) DHL (370C/ 20- 24 h) CHROMTMSalmonella (370C/ 20- 24 h)
Phản ứng lên men đường
Kiểm tra độc lực trên động vật thí nghiệm Xác định khả năng mẫn cảm kháng sinh Xác định các yếu tố độc lực
2.3.4. Phương pháp giám định các đặc tính sinh hóa
Kiểm tra đặc tính sinh hoá của vi khuẩn Salmonella trên môi trường thạch TSI, bằng cách ria cấy trên bề mặt thạch nghiêng và cấy trích sâu một đường xuống đáy ống nghiệm, để tủ ấm 370C trong 24 giờ sau đó xem kết quả: bề mặt ống nghiệm có màu hồng, đường cấy trích sâu có màu đen do sản sinh H2S. Những ống có phản ứng đặc trưng của vi khuẩn Salmonella sẽ được dùng để kiểm tra các phản ứng sinh hoá.
2.3.4.1. Phản ứng chuyển hoá đường: môi trường pepton
- Thành phần: H2O: 1000 ml; Pepton: 15g; Andre: 10 ml.
- Cách pha: trộn đều hỗn hợp trên, đun cho tan hết rồi cho vào mỗi ống 1 ống Ampul. Hấp vô trùng 1210C trong 15 phút, để nguội. Dùng pipet vô trùng nhỏ vào mỗi ống 5-6 giọt đường (mỗi ống 1loại đường). Kiểm tra vô trùng trong tủ ấm ở 370C trong 24h. Sau đó nhỏ 5 - 6 giọt canh trùng để tủ ấm 370C trong 24 giờ.
- Đọc kết quả.
+ Nếu vi khuẩn lên men sinh hơi thì đẩy ống Ampul lên.
+ Nếu vi khuẩn không lên men đường, môi trường không đổi màu. + Nếu vi khuẩn lên men đường, môi trường đổi màu sang màu đỏ.
2.3.4.2. Phản ứng Indole
- Phương pháp tiến hành: cấy vi khuẩn vào môi trường nước thịt để ở nhiệt độ 370C trong 24giờ, sau đó nhỏ từ từ vào thành ống nghiệm 4-5 giọt thuốc thử Kovac.
- Đọc kết quả: Salmonella phản ứng sinh Indol âm tính nên bề mặt môi trường không có màu đỏ đậm.
2.3.4.3. Phản ứng sinh H2S
Phương pháp làm: dùng que cấy đầu nhọn vô trùng lấy vi khuẩn rồi cấy trích sâu vào môi trường TSI agar để tủ ấm 370C trong 24 h. Nếu vi khuẩn sinh H2S thì dọc theo đường cấy sẽ xuất hiện màu đen.
2.3.4.4. Phản ứng Catalase và Oxidase
- Phản ứng Catalase:
+ Phương pháp tiến hành thử như sau:
Lấy một phiến kính sạch, dùng que cấy cẩn thận lấy một phần của khuẩn lạc đặt lên giữa phiến kính. Nhỏ một giọt hydrogen peroxidaza (H2O2) lên vùng có khuẩn lạc. Phản ứng được cho là dương tính nếu ngay sau khi nhỏ chất phản ứng, bọt khí được hình thành. Ngược lại không có bọt khí hình thành, kết quả âm tính.
- Phản ứng Oxidase:
Phản ứng này phụ thuộc vào sự có mặt của các men chứa sắt có trong vi khuẩn. Kết quả làm chuyển nhanh tác nhân của phản ứng từ không màu chuyển sang màu tím đậm trong vòng 10 giây. Nếu thời gian chuyển màu dài hơn, kết quả âm tính. Tác nhân của phản ứng có thể làm khô trên một miếng giấy lọc sạch và khuẩn lạc được nhặt ra và phiết lên. Màu tím xuất hiện sau vài giây thực hiện, phản ứng cho kết quả dương tính.
2.3.5. Phương pháp nhuộm Gram
Nguyên tắc: Nhuộm Gram có vai trò đặc biệt quan trọng trong việc phân loại vi khuẩn. Trong quá trình nhuộm Gram, tế bào bước đầu được xử lý với tím kết tinh và iot nên có sự tạo thành phức chất tím kết tinh iốt bên trong tế bào. Khi vi khuẩn Gram âm bị tẩy cồn, lipit của lớp màng ngoài bị hòa tan làm tăng tính thấm của màng dẫn đến sự rửa trôi phức chất tím-iốt và làm cho vi khuẩn mất màu. Khi nhuộm bổ sung chúng sẽ bắt màu với thuốc (đỏ vàng với Safranin hay đỏ tía với Fuchsin). Ở vi khuẩn Gram dương, cồn làm cho các lỗ trong peptidoglycan co lại do đó phức chất tím - iốt bị giữ lại bên trong tế bào.
Tiến hành: Lấy một giọt nước cất vô trùng nhỏ lên lam kính. Dùng que cấy vòng lấy mẫu. Hòa mẫu vào giọt nước và dàn đều trên lam kính có đường kính khoảng 1-2cm. Cố định tiêu bản trên ngọn lửa đèn cồn. Nhuộm bằng dung dịch tím kết tinh (crystal violet) trong khoảng 1 phút, rửa bằng nước. Nhuộm tiếp bằng dung dịch lugol trong 1 phút, rửa lại bằng nước. Tẩy màu bằng dung dịch etanol (etanol 95% - axeton 1:1) trong 30 giây. Sau đó nhuộm tiếp bằng safranin trong 30 giây,
rửa qua nước, thấm khô. Nhỏ dầu lên tiêu bản và quan sát dưới kính hiển vi điện tử ở vật kính dầu 100X.
Kết quả: Khi soi dưới kính hiển vi điện tử vi khuẩn Gram dương có màu tím, vi khuẩn Gram âm có màu hồng (Nguyễn Lân Dũng và cs 1972)[6].
2.3.6. Phương pháp xác định serotype của các chủng Salmonella phân lập được
Chúng tôi sử dụng kháng huyết thanh đơn giá O, H của hãng SIFIN (Đức) và Bio RAD (Pháp).
Sử dụng khay thuỷ tinh trong đó có các giếng nhỏ. Nhỏ 1 giọt kháng huyết thanh vào giếng, dùng que cấy vô trùng lấy 1 phần khuẩn lạc cần định type từ thạch nuôi cấy, trộn đều khuẩn lạc và kháng huyết thanh, lắc nhẹ và quan sát:
+ Phản ứng dương tính: có sự hình thành các hạt ngưng kết nhỏ li ti.
+ Phản ứng âm tính: huyễn dịch vi khuẩn và kháng huyết thanh đồng nhất không có những hạt nhỏ li ti mà có màu trắng sữa hơi đục.
Đối với các chủng sau khi định được kháng nguyên O, H1 mà chưa định được type thì phải xác định pha 2 của kháng nguyên H. Sau khi xác định kháng nguyên H pha 1 theo sơ đồ trên, tiến hành xác định pha 2 như sau:
- Chuẩn bị thạch Sven Gard: đây là môi trường bán cố thể, có bán sẵn trên thị trường, chỉ cần pha theo hướng dẫn của nhà sản xuấ t. Dùng đĩa có đường kính 6cm trước khi đổ thạch nhỏ 1 giọt nhỏ Anti Sven Gard Ser um với mục đích ức chế pha 1.Tuỳ theo pha 1 mà có loại Anti Sven Gard Serum khác nhau ví dụ SG1, SG2, SG3, SG4, SG5, SG6.
- Sau khi đã có thạch Sven Gard, dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn đã xác định được kháng nguyên H pha 1, chấm nhẹ lên bề mặt thạch ở giữa đĩa thạch.
- Nuôi ở 370 C/24h.
- Tiến hành phản ứng ngưng kết nhanh trên phiến kính tương tự như đối với pha 1. Xác định type Salmonella bằng kháng huyết thanh theo KauffmannWhite (Salmonella serotyping following Kauffmann Scheme) (năm 1972).
Bảng 2.1. Bảng cấu trúc kháng nguyên của một số loài Salmonella
Nhóm Type Kháng nguyên O Kháng nguyên H
Pha 1 Pha 2 A S. paratyphi A 1,2,12 A - B S. paratyphi B 1,4,5,12 1 1,2 S. typhimurium 1,4,5,12 I 1,2 S. derby 1,4,5,12 f,g [1,2] S. Essen 4,12, G,m - S. Brandenburg 4,12 l,v e,n,z15 C1 S. Paratyphi C 6,7 (vi) C 1,5 S. Cholerae suis 6,7 C 1,5 S. bareilly 6,7 I 1,5 D S. enteritidis 1,9,12 G,m 1,5 S. dublin 1,9,12 g,p - S. typhi 1,9, Vi c,d - S. gallinarum 1,9,12 - - S. pullorum 9,12 - -
2.3.7. Phương pháp xác định các yếu tố gây bệnh của vi khuẩn phân lập được
2.3.7.1. Phương pháp kiểm tra một số yếu tố gây bệnh (độc tố đường ruột (Stn), yếu tố xâm nhập (InvA) của các chủng Salmonella bằng phương pháp PCR
* Tách ADN:
Các chủng vi khuẩn cần kiểm tra được nuôi cấy trên môi trường thạch máu ở 37oC trong 24 giờ. Lấy 1 – 2 khuẩn lạc hòa vào 300 µl nước khử ion vô trùng. Đun cách thủy ở 100oC trong 15 phút, ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút. Hút phần dịch nổi có chứa ADN để làm phản ứng PCR.
* Primer (mồi):
Trình tự các các cặp mồi và kích thước các sản phẩm PCR dùng để xác định độc tố đường ruột (Stn), yếu tố xâm nhập (InvA) và gen kháng kháng sinh DT104
(definitive phage type 104) của Salmonella dựa trên các nghiên cứu đã được công bố của các tác giả.
Bảng 2.2. Trình tự các cặp mồi và kích cỡ sản phẩm để xác định một số yếu tố gây bệnh của Salmonella phân lập được.
Ký hiệu mồi Trình tự mồi Sản phẩm (bp)
1. Gen sản sinh độc tố đƣờng ruột
Stn- F Stn- R
5‟- CTTTGGTCGTAAATAAGGCG- 3‟
5‟- TGCCCAAAGCAGAGAGATTC- 3‟ 259
2. Gen quyết định yếu tố xâm nhập InvA
InvA- F InvA- R 5‟- TTGTTACGGCTATTTTGACCA- 3‟ 5‟- CTGACTGCTACCTTGCTGATG- 3‟ 521 3. 3. Gen kháng kháng sinh DT 104 104SR- F 104SR-R 5‟- GTCAGCAGTGTATGGAGCGA- 3‟ 5‟- AGTAGCGCCAGGACTCGTTA- 3‟ 162 * Hỗn hợp phản ứng PCR bao gồm các thành phần: - 5µl PCR buffer 5x [( 750mM Tris-HCl (pH 8.8), 200mM (NH4)2SO4, 0,1% Tween 20) (ABgene), 2mM MgCl2,200µM của mỗi loại dNTP].
- 1 µl mỗi loại primer (3,2 µM /µl).
- 0,05 µl Taq DNA Polymerase ( 5 units/µl) (Abgene). - Nước cất vừa đủ 25 µl cho một phản ứng.
Tiến hành phản ứng trong máy PCR theo các giai đoạn: Tiền biến ở 94oC/ 5 phút và 30 chu kỳ nhiệt (biến tính 94oC/1 phút, ủ bắt cặp mồi 50o
C/1 phút, kéo dài 72oC/1 phút), và kéo dài cuối cùng ở 72oC/ 7 phút.
* Chạy điện di:
Sản phẩm PCR thu được sau chu trình phản ứng được nhuộm với chất nhuộm nhỏ mẫu (Loading dye), trộn vào mẫu theo tỉ lệ 1:5. Sau khi nhuộm sản phẩm PCR được chạy điện di trên Gel Agarose 2% trong dung dịch đệm TAE (Tris- Acetate- EDTA) với hiệu điện thế 100V trong 30 phút.
* Nhuộm:
Gel sau khi chạy điện di được nhuộm bằng chất nhuộm màu huỳnh quang Ethidium Bromide (1 µl/ml) trong vòng 15 phút.
* Đọc kết quả:
Đọc kết quả bằng cách quan sát dưới đèn UV (300 nm) và chụp ảnh bằng hệ thống Gel Doc. Kích thước các băng ADN được so với ADN chuẩn (ADN marker).
2.3.7.2. Phương pháp xác định độc lực của các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập được
Xác định độc lực của các chủng Salmonella gây bệnh được thực hiện bằng phương pháp tiêm truyển động vật thí nghiệm. Các bước thực hiện như sau:
Bước 1: Các chủng vi khuẩn thuần từ môi trường giữ giống được cấy vào môi trường BHI trong bình tam giác 100ml, sau đó canh trùng được bồi dưỡng ở 37oC trong 24 giờ, trong quá trình nuôi có lắc để kích thích sự tăng sinh của vi khuẩn.
Bước 2: Tiêm mỗi chủng vi khuẩn cần nghiên cứu cho 2 chuột nhắt trắng khỏe mạnh, khối lượng từ 18-20g/con, với liều 0,2 mg/chuột, tiêm vào xoang phúc mạc. Trong thí nghiệm, mỗi lô chuột để 2 con tiêm dung dịch BHI làm đối chứng.
Bước 3: Cho chuột ăn uống bình thường và theo dõi những biểu hiện triệu chứng phản ứng sau tiêm. Kiểm tra và đánh giá số chuột tới 7 ngày.
Căn cứ vào số lượng chuột chết, giờ chuột chết bình quân của mỗi lô để đánh giá độc lực của vi khuẩn.
Bước 4: Những chuột chết được đánh giá qua lâm sàng mổ khám, kiểm tra sự biến đổi của các cơ quan nội tạng, sau đó tiến hành nuôi cấy và phân lập lại vi khuẩn từ các mẫu bệnh phẩm (máu tim) của chuột chết.
2.3.8. Phương pháp xác định tính mẫn cảm với một số kháng sinh của vi khuẩn Salmonella gallinarum pullorum Salmonella gallinarum pullorum
Khả năng mẫn cảm với kháng sinh của các chủng vi khuẩn Salmonella spp, phân lập được kiểm tra bằng phương pháp khuyếch tán trên đĩa thạch và đánh giá kết quả theo Hội đồng quốc gia Hoa Kỳ về các tiêu chuẩn lâm sàng phòng thí nghiệm
Dùng môi trường Muller Hinton Agar, cân môi trường 38 g pha với 1 lít nước cất sau khi pha môi trường thành màu vàng nhạt, để nguội môi trường sẽ đông lại.
- Cách tiến hành: Dùng pipet hút 0,1 ml canh khuẩn 24h ở môi trường BHI vào ống nghiệm trộn đều với 0,9 ml nước muối sinh lý 0,9% ta được nồng độ 10-1
, sau đó ta lại hút 0,1 ml sang ống nghiệm thứ 2 ta được nồng độ 10-2, tiếp tục hút 0,1 ml sang ống nghiệm thứ 3 ta được nồng độ 10-3, ống thứ 3 được sử dụng làm kháng sinh đồ.
Hút 0,5 ml đã pha loãng nồng độ 10-3
nhỏ toàn bộ dung dịch này lên mặt thạch sau đó dùng ống nghiệm đã hấp vô trùng láng đều dung dịch trên môi trường thạch đĩa.
Đặt nhẹ các khoanh giấy kháng sinh chế sẵn lên mặt thạch đĩa. Các khoanh giấy kháng sinh đặt cách nhau 2cm không quá 6 khoanh giấy kháng sinh trong một đĩa thạch. Sau đó bồi dưỡng ở tủ ấm 37o
C ở 24 h. Đánh giá tính mẫn cảm với kháng sinh dựa trên đường kính vòng vô khuẩn.
Bảng 2.3. Tiêu chuẩn đánh giá mức độ mẫn cảm và kháng kháng sinh theo CCLS (1999)
TT Loại kháng sinh Đƣờng kính vòng vô khuẩn (mm)
Mẫn cảm cao Mẫn cảm trung bình Kháng thuốc
1 Ceftiofur 21 18 – 20 < 17 2 Colistin ≥ 15 13 – 14 ≤ 12 3 Enrofloxacin 20 17 – 19 < 16 4 Gentamicin ≥ 13 - ≤ 12 5 Trimethoprim + Sulfamethoxozol ≥ 16 11 - 15 ≤ 10 6 Norfloxacin 17 13 – 16 < 12 7 Neomycin ≥ 15 13 – 14 ≤ 12 8 Kanamycin ≥ 18 14 – 17 ≤ 13 9 Tetracycline ≥ 23 19 – 22 ≤ 18
2.3.9. Phương pháp nghiên cứu đánh giá tác dụng của chế phẩm Biovet
Tôi tiến hành bố trí thí nghiệm có bổ sung chế phẩm Biovet vào thức ăn cho đàn gà thí nghiệm. Sau đó, theo dõi các chỉ tiêu về sinh trưởng, chỉ tiêu về thức ăn và sự biến động về số lượng Salmonella spp trong đường ruột của gà thí nghiệm.
2.3.9.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí theo phương pháp phân lô so sánh đảm bảo nguyên tắc đồng đều về giống, tuổi, khối lượng, điều kiện nuôi dưỡng, mật độ nhốt, mật độ máng ăn, uống, chế độ chiếu sáng, trên cùng một nền thức ăn.
Mỗi lô 100 con, thời giam nuôi từ 1-84 ngày
Chỉ khác lô thí nghiệm có bổ sung men Biovet vào thức ăn còn lô đối chứng thì cho ăn thức ăn thông thường không bổ sung men.
Thí nghiệm được nuôi theo phương thức nuôi nhốt trên nền đệm lót bằng trấu đảm bảo các yếu tố cần thiết, chuồng sạch thoáng mát về mùa hè, ấm áp về mùa đông.
2.3.9.2. Thức ăn cho gà thí nghiệm
Thức ăn cho gà ở cả hai lô đều sử dụng loại thức ăn hỗn hợp dạng viên VCB của Công ty thức ăn chăn nuôi MINH HIẾU. Gà từ 1-28 ngày tuổi dùng cám giai đoạn từ 1-28 ngày tuổi, từ ngày 29 đến 84 ngày thì cám giai đoạn 29 ngày đến xuất chuồng.
2.3.9.3. Xác định các chỉ tiêu nghiên cứu
Để tiến hành khả năng sinh trưởng của gà tôi tiến hành cân gà kiểm tra trọng lượng gà theo tuần tuổi và khi kết thúc thí nghiệm. Kết quả cân được ghi lại để so sánh và phân tích với những lần kiểm tra trọng lượng sau đó.
* Chỉ tiêu về tỷ lệ nuôi sống
Số con cuối kỳ (con) Tỷ lệ nuôi sống (%) =
Số con đầu kì (con) * Chỉ tiêu về sinh trưởng của gà thí nghiệm
- Sinh trưởng tích lũy (g/con): để nghiên cứu chỉ tiêu này tôi dựa vào khối