2.3.7.1. Phương pháp kiểm tra một số yếu tố gây bệnh (độc tố đường ruột (Stn), yếu tố xâm nhập (InvA) của các chủng Salmonella bằng phương pháp PCR
* Tách ADN:
Các chủng vi khuẩn cần kiểm tra được nuôi cấy trên môi trường thạch máu ở 37oC trong 24 giờ. Lấy 1 – 2 khuẩn lạc hòa vào 300 µl nước khử ion vô trùng. Đun cách thủy ở 100oC trong 15 phút, ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút. Hút phần dịch nổi có chứa ADN để làm phản ứng PCR.
* Primer (mồi):
Trình tự các các cặp mồi và kích thước các sản phẩm PCR dùng để xác định độc tố đường ruột (Stn), yếu tố xâm nhập (InvA) và gen kháng kháng sinh DT104
(definitive phage type 104) của Salmonella dựa trên các nghiên cứu đã được công bố của các tác giả.
Bảng 2.2. Trình tự các cặp mồi và kích cỡ sản phẩm để xác định một số yếu tố gây bệnh của Salmonella phân lập được.
Ký hiệu mồi Trình tự mồi Sản phẩm (bp)
1. Gen sản sinh độc tố đƣờng ruột
Stn- F Stn- R
5‟- CTTTGGTCGTAAATAAGGCG- 3‟
5‟- TGCCCAAAGCAGAGAGATTC- 3‟ 259
2. Gen quyết định yếu tố xâm nhập InvA
InvA- F InvA- R 5‟- TTGTTACGGCTATTTTGACCA- 3‟ 5‟- CTGACTGCTACCTTGCTGATG- 3‟ 521 3. 3. Gen kháng kháng sinh DT 104 104SR- F 104SR-R 5‟- GTCAGCAGTGTATGGAGCGA- 3‟ 5‟- AGTAGCGCCAGGACTCGTTA- 3‟ 162 * Hỗn hợp phản ứng PCR bao gồm các thành phần: - 5µl PCR buffer 5x [( 750mM Tris-HCl (pH 8.8), 200mM (NH4)2SO4, 0,1% Tween 20) (ABgene), 2mM MgCl2,200µM của mỗi loại dNTP].
- 1 µl mỗi loại primer (3,2 µM /µl).
- 0,05 µl Taq DNA Polymerase ( 5 units/µl) (Abgene). - Nước cất vừa đủ 25 µl cho một phản ứng.
Tiến hành phản ứng trong máy PCR theo các giai đoạn: Tiền biến ở 94oC/ 5 phút và 30 chu kỳ nhiệt (biến tính 94oC/1 phút, ủ bắt cặp mồi 50o
C/1 phút, kéo dài 72oC/1 phút), và kéo dài cuối cùng ở 72oC/ 7 phút.
* Chạy điện di:
Sản phẩm PCR thu được sau chu trình phản ứng được nhuộm với chất nhuộm nhỏ mẫu (Loading dye), trộn vào mẫu theo tỉ lệ 1:5. Sau khi nhuộm sản phẩm PCR được chạy điện di trên Gel Agarose 2% trong dung dịch đệm TAE (Tris- Acetate- EDTA) với hiệu điện thế 100V trong 30 phút.
* Nhuộm:
Gel sau khi chạy điện di được nhuộm bằng chất nhuộm màu huỳnh quang Ethidium Bromide (1 µl/ml) trong vòng 15 phút.
* Đọc kết quả:
Đọc kết quả bằng cách quan sát dưới đèn UV (300 nm) và chụp ảnh bằng hệ thống Gel Doc. Kích thước các băng ADN được so với ADN chuẩn (ADN marker).
2.3.7.2. Phương pháp xác định độc lực của các chủng vi khuẩn Salmonella phân lập được
Xác định độc lực của các chủng Salmonella gây bệnh được thực hiện bằng phương pháp tiêm truyển động vật thí nghiệm. Các bước thực hiện như sau:
Bước 1: Các chủng vi khuẩn thuần từ môi trường giữ giống được cấy vào môi trường BHI trong bình tam giác 100ml, sau đó canh trùng được bồi dưỡng ở 37oC trong 24 giờ, trong quá trình nuôi có lắc để kích thích sự tăng sinh của vi khuẩn.
Bước 2: Tiêm mỗi chủng vi khuẩn cần nghiên cứu cho 2 chuột nhắt trắng khỏe mạnh, khối lượng từ 18-20g/con, với liều 0,2 mg/chuột, tiêm vào xoang phúc mạc. Trong thí nghiệm, mỗi lô chuột để 2 con tiêm dung dịch BHI làm đối chứng.
Bước 3: Cho chuột ăn uống bình thường và theo dõi những biểu hiện triệu chứng phản ứng sau tiêm. Kiểm tra và đánh giá số chuột tới 7 ngày.
Căn cứ vào số lượng chuột chết, giờ chuột chết bình quân của mỗi lô để đánh giá độc lực của vi khuẩn.
Bước 4: Những chuột chết được đánh giá qua lâm sàng mổ khám, kiểm tra sự biến đổi của các cơ quan nội tạng, sau đó tiến hành nuôi cấy và phân lập lại vi khuẩn từ các mẫu bệnh phẩm (máu tim) của chuột chết. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.3.8. Phương pháp xác định tính mẫn cảm với một số kháng sinh của vi khuẩn Salmonella gallinarum pullorum