Nhân giống cấp 1 trong các bình nĩn, thể tích 80 ml mơi trường. Giống vi khuẩn tinh khiết được cho vào các bình nhân giống cấp 1, để ở 30 oC / 72 giờ. Đếm số vi khuẩn / ml dịch nuơi cấy.
4. Nhân giống cấp 2
Cho vi khuẩn đã nhân giống cấp 1 vào các bình mơi trường, đếm số vi khuẩn /ml để điều chỉnh sao cho đạt số lượng vi khuẩn ban đầu vào khoảng 1x 106 vi khuẩn / ml mơi trường. Cĩ thể sử dụng một trong 2 phương pháp nhân giống sau:
- Nhân giống bằng phương pháp động: dùng 8 bình nhân giống thể tích 2 lít, lắc ở máy lắc CERTOMAT BS-1, vận tốc 200 vịng/ phút, nhiệt độ 30 oC/ 72 giờ.
- Nhân giống bằng phương pháp tĩnh: dùng bình thể tích 10 lít, dùng 4 bình, để bình ở nhiệt độ phịng, thời gian nhân giống là 86 giờ.
- Kiểm tra sinh khối tạo thành: bao gồm lượng sinh khối phải đạt 108CFU/ml mơi trường và khơng được nhiễm vi khuẩn lạ.
Mơi trường nhân giống
Giống A. xylinum
Hoạt hĩa lần 1
Hoạt hĩa lần 2
Thu hoạch giống A. xylinum đã hoạt hĩa
Thu hoạch giống cho giai đoạn lên men
3.3. Xây dựng qui trình lên men tạo màng BC
3.3.1. Khảo sát các điều kiện lên men A. xylinum thu BC 3.3.1.1. Xác định mơi trường lên men 3.3.1.1. Xác định mơi trường lên men
Nguồn carbon
Sử dụng nguồn carbon là glucose bổ sung vào mơi trường cơ bản và khảo sát nồng độ đường thích hợp cho quá trình lên men tạo BC. So sánh với nguồn carbon là saccharose.
Điều kiện thử nghiệm: vi khuẩn nhân giống đã xác định số lượng ban đầu được đưa vào lần lượt các mơi trường khảo sát cĩ các nồng độ glucose (g/l) 0, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40. Mỗi nồng độ đường nuơi cấy trong 50 hộp. Nuơi cấy tĩnh trong 7 ngày, thu BC, tinh chế và sấy đến trọng lượng khơng đổi, cân. Thử nghiệm thực hiện 5 lần và tính giá trị trung bình.
Bảng 3.18. Ảnh hưởng của nồng độ đường lên khả năng tạo cellulose của A. xylinum
Hiệu suất tạo BC (g/ l) Nồng độ đường (g/l) Glucose X ± SD, n =5 Saccharose X ± SD, n = 5 0 2,01 ± 0,12 2,01 ± 0,12 10 4,20 ± 0,16 3,12 ± 0,23 15 4,37 ± 0,15 3,32 ± 0,18 20 4,58 ± 0,22 3,41 ± 0,15 25 4,07 ± 0,16 3,45 ± 0,21 30 4,02 ± 0,21 4,02 ± 0,19 35 3,95 ± 0,19 3,74 ± 0,22 40 3,80 ± 0,23 3,55 ± 0,18
Kết quả: kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ đường glucose cho thấy nồng độ đường cĩ ảnh hưởng đến hiệu suất tạo BC. Ở nồng độ đường glucose 20 g/l cho lượng BC cao nhất, khi tăng nồng độ đường glucose lên cao hơn, sự tạo BC giảm do áp suất thẩm thấu cao ảnh hưởng đến sự hấp thu của vi khuẩn. Sử dụng saccharose cho hiệu suất kém hơn.
Nguồn nitơ
Khảo sát hiệu suất tạo BC trên các mơi trường khơng cĩ pepton và cĩ pepton. Sử dụng mơi trường số 4 với hàm lượng glucose 20 g/l và bổ sung pepton như nguồn nitơ theo Bảng 3.15.
Bảng 3.19. Nguồn nitơ sử dụng trong quá trình lên men thu BC
Kết quả: nguồn nitơ cĩ ảnh hưởng trên quá trình tạo BC nhưng cĩ sự khác biệt khơng nhiều ở hai nồng độ 5 g/l và 10 g/l. Tuy nồng độ pepton 10 g/l giúp quá trình tạo màng nhanh hơn do khả năng làm tăng sinh nhanh lượng giống ban đầu đưa vào nhưng sử dụng nồng độ 5 g/l sẽ cĩ hiệu quả kinh tế hơn,
Kết luận: nồng độ pepton 5 g/l là nồng độ được lựa chọn cho qui trình lên men.
Xác định pH thích hợp
Điều kiện thử nghiệm: mơi trường nuơi cấy được điều chỉnh về các pH 4,5; 5,5; 6; 7. Cho dịch nhân giống vào lần lượt các mơi trường cĩ pH như trên, đổ vào các hộp nuơi cấy tĩnh, thực hiện 5 lần và lấy kết quả trung bình. Thu BC thơ từ các hộp và xử lý để được BC tinh chế, sấy đến trọng lượng khơng đổi và cân tất cả màng ở mỗi lơ (P). Đánh giá hiệu quả lên men dựa vào lượng cellulose thu được.
Ở mỗi lơ đếm số hộp bị nhiễm vi khuẩn lạ hoặc nấm mốc để tính tỷ lệ ngoại nhiễm. Thực hiện 5 lần.
Kết quả: pH thích hợp cho quá trình lên men tạo BC nằm trong khoảng pH 5,5- 7,0. pH 4,5 cho hiệu suất thấp hơn nhưng cũng đạt tới 96,9 % so với hiệu suất cao nhất là pH 6. Ở pH cao quá trình lên men dễ bị nhiễm bởi vi sinh vật lạ hơn ở pH thấp. Trong mơi trường lên men với nồng độ đường cao, vi khuẩn A. xylinum tạo acid như sản phẩm phụ trong quá trình lên men tạo cellulose. Ngồi khả năng tác động lên quá
Nồng độ pepton (g/ l)
Hiệu suất tạo BC (g/l) X ± SD, n = 5
Thời gian tạo BC tối đa (ngày)
0 2, 15 ± 0,09 9
5 4,58 ± 0,11 6
trình tạo BC, acid tạo thành cịn cĩ khả năng ngăn cản sự ngoại nhiễm. Mơi trường pH acid (pH 4,5) cĩ khả năng ngăn sự ngoại nhiễm gấp 10 lần mơi trường pH 7. (Bảng 3.22) Điều này cĩ ý nghĩa lớn trong việc chế tạo màng BC sử dụng làm màng trị bỏng vì những hộp lên men bị nhiễm sẽ khơng thể sử dụng được do BC bị giảm chất lượng, độ bền cơ học giảm và màng khơng cịn khả năng cản khuẩn.
Bảng 3.20. Hiệu suất tạo BC và tỷ lệ ngoại nhiễm ở những pH mơi trường lên men khác nhau
pH Hiệu suất tạo BC (g/ l)
X ± SD, n=5
Thời gian tạo màng BC tối đa (ngày)
Tỷ lệ ngoại nhiễm (%) 4,5 4,43 ±0,13 6 1,2 5.5 4,51 ±0,17 6 5,7 6 4,54 ±0,14 6 6,5 7,0 4,53 ±0,19 6 10,3
Kết luận: pH mơi trường là pH 4,5 được áp dụng cho qui trình lên men tạo BC.
3.3.1.2. Xác định lượng giống sử dụng ban đầu.
Lượng giống ban đầu cĩ thể ảnh hưởng đến thời gian và năng suất tạo BC. Việc xác định lượng giống thích hợp sẽ tiết kiệm mơi trường và nâng cao hiệu quả của quá trình lên men.
Sử dụng mơi trường lên men với các điều kiện đã được khảo sát và bổ sung những lượng giống ban đầu khác nhau.(Bảng 3.23) Sau thời gian lên men tạo màng, thu BC thơ, tinh chế và xác định hiệu suất tạo BC được tính bằng gam BC tinh chế / lít mơi trường.
Kết quả: theo kết quả Bảng 3.21, với lượng vi khuẩn ban đầu thấp từ 104 - 105 vi khuẩn / ml, lượng BC thu được chỉ bằng từ 73 % - 82 % so với lượng giống ở những lơ cĩ số vi khuẩn ban đầu là 106 vi khuẩn / ml và thời gian lên men cũng kéo dài thêm 3 ngày. Mặt khác, khi tăng lượng giống lên 107 vi khuẩn / ml, lượng BC thu được chỉ tăng 1,2 % so với việc sử dụng giống ở mức 106 vi khuẩn / ml mơi trường
Bảng 3.21. Ảnh hưởng của lượng giống trên hiệu suất và thời gian tạo BC
Số vi khuẩn ban đầu
(vi khuẩn / ml)
Hiệu suất tạo BC (g/ l)
X ± SD, n = 5
Thời gian tạo màng BC tối đa (ngày)
1.3 x 104 3,53 ±0,16 9
1.3 x 105 3,83 ±0,17 9
1.3 x 106 4,52 ± 0,12 6
1.3 x 107 4,51 ± 0,14 6
Kết luận: sử dụng lượng giống ban đầu khoảng 106 vi khuẩn / ml mơi trường là lượng giống thích hợp cho qui trình lên men thu BC.
3.3.2. Qui trình lên men
Từ các kết quả thực nghiệm trên, chúng tơi xây dựng qui trình lên men như sau: