a. Đối tượng thử nghiệm: màng BC tinh chế và màng thành phẩmAcetul b Bố trí thí nghiệm
c.2. Xây dựng qui trình kiểm nghiệm màng Acetul
Phương pháp khảo sát pH của màng Acetul
Cân và cho màng vào 1 bình nĩn chứa nước khử khống tỷ lệ màng và nước là 1:100 (khối lượng / thể tích). Đặt bình vào máy lắc ở nhiệt độ phịng trong 3 giờ. Sau đĩ cho dịch chiết vào bình lắng tách bỏ phần dầu, chỉ dùng phần dịch trong để đo pH. Đo pH dung dịch ở mỗi bình bằng pH kế, chỉnh pH điện cực ở 2 khoảng pH 7 và pH 4.
Phương pháp định lượng các hoạt chất trong màng
Định lượng hoạt chất tái sinh mơ
Cắt màng Acetul (10 cm x 10 cm) thành 4 mảnh nhỏ, (2,5 cm x 2,5 cm) cho vào bình nĩn 100 ml cĩ nút mài. Thêm 20 ml ether, lắc rồi để trong 5 phút, tách lấy dịch ether. Tiếp tục chiết thêm 1 lần với 40 ml ether. Dùng kẹp lấy những mảnh màng cho vào một bình lắng. Thêm 30 ml ether, lắc kỹ, thu hồi ether vào bình cĩ chứa các dịch chiết ở lần 1 và 2. Lắc dịch ether lại với 50 ml nước, tách lấy dịch ether. Làm bay hơi dịch ether. Cân lại hộp cho đến khi trọng lượng khơng đổi. Xác định khối lượng hoạt chất tái sinh mơ thu được.
Hoạt chất tái sinh mơ được tiếp tục định lượng acid béo bằng phương pháp HPLC: thử nghiệm được thực hiện tại Trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm TP. Hồ Chí Minh.
Định lượng tinh dầu tràm trà Úc
Tinh dầu tràm trà Úc được tách khỏi màng bằng phương pháp cất kéo hơi nước sau đĩ đo thể tích. Thử nghiệm được tiến hành tại Trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm TP. Hồ Chí Minh.
Thử tính kích ứng da của màng Acetul
Thử kích ứng trên da là một phương pháp sinh học dựa vào mức độ phản ứng của da thỏ với vật liệu thử so với phần da kế bên khơng đắp vật liệu thử. Tiến hành theo phương pháp thử kích ứng trên da áp dụng cho các sản phẩm dùng trong y tế và mỹ phẩm theo Quyết định số 3113/ 1999/ QĐ-BYT ngày 11 tháng 10 năm 1999 của Bộ Y tế.
Thú thử nghiệm và điều kiện thí nghiệm: sử dụng thỏ trắng trưởng thành, đực hoặc cái (khơng sử dụng thỏ cĩ thai hoặc đang cho con bú), khoẻ mạnh, cân nặng khơng dưới 2 kg. Thỏ được nhốt riêng từng con và nuơi dưỡng trong điều kiện thí nghiệm ít nhất 5 ngày trước khi thử. Trước ngày thí nghiệm, làm sạch lơng thỏ ở vùng lưng đều về hai bên cột sống một khoảng đủ rộng để đặt các mẫu thử là màng Acetul (khoảng 10 cm x 15 cm). Chỉ những thỏ cĩ da khoẻ mạnh, đồng đều và lành lặn mới được dùng vào thí nghiệm. Thí nghiệm tiến hành trên 3 thỏ. Đặt màng Acetul cĩ kích thước 2,5 cm x 2,5 cm lên vùng da thỏ đã được cạo lơng 24 giờ trước đĩ. Cố định miếng màng bằng băng dính khơng gây kích ứng trong 4 giờ. Sau đĩ bỏ màng và băng dính, làm sạch vùng da bằng dung mơi thích hợp khơng gây kích ứng.
Quan sát và ghi điểm: quan sát và ghi điểm phản ứng trên chỗ da đặt màng Acetul so với da kề bên khơng đặt màng ở các thời điểm 1 giờ, 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ sau khi làm sạch mẫu thử.
Đánh giá phản ứng trên da ở các mức độ gây ban đỏ, phù nề theo quy định.
Đánh giá kết quả: trên mỗi thỏ, điểm phản ứng được tính ở 2 mức độ ban đỏ và phù nề chia cho số lần quan sát. Điểm kích ứng của mẫu thử được lấy trung bình điểm phản ứng của các thỏ đã thử. Chỉ sử dụng các điểm ở những thời gian quan sát ở 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ để tính kết quả. Đối chiếu điểm kích ứng ở các mức độ quy định để xác định khả năng gây kích ứng trên da thỏ của mẫu thử. (Phụ lục)
Thử nghiệm tính kháng khuẩn của màng trị bỏng Acetul
Phương pháp thử nghiệm trên mơi trường rắn: khảo sát khả năng ức chế sự tăng trưởng của vi khuẩn thử nghiệm của màng Acetul khi đặt màng trên bề mặt bản thạch dinh dưỡng cĩ trải vi khuẩn thử nghiệm.
Vi khuẩn thử nghiệm: Staphylococcus aureus, Streptococcus hemolyticus, Pseudomonas aeuginosa, MRSA. Vi khuẩn được phân lập trên mơi trường thích hợp, để 24 giờ (mơi trường thử nghiệm kháng sinh tiêu chuẩn 2 đối với thử nghiệm
Staphylococcus aureus, Streptococcus hemolyticus, MRSA và mơi trường thạch
Pseudomonas đối với thử nghiệm trên Pseudomonas aeruginosa). Lấy 3 – 5 khĩm vi khuẩn cấy vào mơi trường canh thang dinh dưỡng, ủ ở 35 oC trong 6 giờ. Sử dụng vi khuẩn này pha một huyền trọc vi khuẩn cĩ mật độ vi khuẩn vào khoảng 1 x 106 CFU/ ml – 2 x 106 CFU / ml.
Chuẩn bị mẫu: dùng một kéo vơ khuẩn cắt đơi màng Acetul.
Phương pháp: dùng que bơng vơ khuẩn tẩm huyền trọc vi khuẩn trải đều trên bề mặt hộp thạch chứa mơi trường thử nghiệm. Lấy ½ miếng màng Acetul ra khỏi bao và đặt trên ½ mặt bản thạch, ép sát màng vào bề mặt bản thạch. Dùng băng parafin dán kín hộp thạch thử nghiệm. Ủ hộp thạch ở 35 oC trong 24 giờ, sau đĩ quan sát sự tăng trưởng của vi khuẩn. Kết quả được so sánh với mẫu chứng
Mẫu chứng: mẫu chứng thử nghiệm trên màng BC tinh chế chưa phối hợp với các chất kháng khuẩn. Thử nghiệm trên mẫu chứng giống như thực hiện trên mẫu thử.
Đánh giá kết quả: màng cĩ khả năng ức chế vi khuẩn khi phần thạch cĩ phủ màng khơng cĩ sự tăng trưởng của vi khuẩn (quan sát bằng mắt thường) và tạo vùng vơ khuẩn. Phần khơng phủ màng vi khuẩn phát triển mạnh.
Thử nghiệm độ vơ khuẩn của màng Acetul
Thử nghiệm độ vơ khuẩn của màng Acetul được thực hiện theo phương pháp thử nghiệm trong chuyên đề “Thử độ vơ khuẩn của sản phẩm” phương pháp dùng màng lọc trong USP 28.[75]
d. Các chỉ tiêu theo dõi
e. Sản phẩm nội dung cần đạt
- Qui trình kiểm nghiệm màng Acetul