• Chủng vi khuẩn tạo cellulose Acetobacter xylinum do Viện Sinh học nhiệt đới TP. Hồ Chí Minh cung cấp.
Kiểm tra độ tinh khiết của giống vi khuẩn A. xylinum, sau đĩ hoạt hĩa giống để đạt lượng vi khuẩn 108 CFU/ ml mơi trường nuơi cấy và sử dụng nguồn giống này để thử nghiệm khảo sát mơi trường, điều kiện nuơi cấy thích hợp cho giai đoạn nhân giống. Mơi trường khảo sát: sử dụng mơi trường cơ bản sau đây và bổ sung pepton, glucose ở những nồng độ khác nhau để xác định nồng độ thích hợp trong mơi trường:
Amoni sulfat 0,5g Diamoni phosphat 0,3g Glucose 5 g/l
Nước dừa già vừa đủ 1000 ml.
b. Bố trí thí nghiệm
Qui mơ: mỗi mẻ nhân giống với thể tích 8lít giống (nuơi cấy lắc), 30 lít (nuơi cấy tĩnh). Xác định các thơng số thích hợp cho qui trình nhân giống được thực hiện lặp lại 5 lần.
Thời gian: tháng 1/2008 – 7/2008
Địa điểm: thử nghiệm được thực hiện tại Phịng thí nghiệm Vi sinh Cơng nghệ, BM Vi sinh – Ký sinh Khoa Dược, ĐH Y Dược TP.HCM
c. Phương pháp nghiên cứu
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng trong quá trình nuơi cấy nhân giống gồm cĩ:
- Khảo sát mơi trường nuơi cấy nhân giống: nhằm xác định nguồn nitơ thích hợp và ảnh hưởng của yếu tố tăng trưởng.
- Xác định các yếu tố vật lý ảnh hưởng đến quá trình nhân giống như yếu tố thơng khí trong quy trình nuơi cấy, pH mơi trường thích hợp cho sự tăng trưởng và thời gian nhân giống.
- Xác định đường cong tăng trưởng để biết thời gian thu sinh khối thích hợp. Qui trình nhân giống gồm các giai đoạn:
Giai đoạn hoạt hĩa giống: đây là giai đoạn chuyển giống từ trạng thái tiềm ẩn sang giai đoạn tăng sinh (giai đoạn logarit) cĩ khả năng tăng sinh nhanh và các đặc tính sinh hĩa ổn định.
- Hoạt hĩa lần thứ nhất: lấy vi khuẩn trong mơi trường thạch nghiêng của ống gốc cho vào 50 ml mơi trường nhân giống, cho vào máy lắc, nhiệt độ 30 oC trong 72 giờ. - Kiểm tra giống: sau khi hoạt hĩa, kiểm tra tính tinh khiết của giống. Giống khơng được nhiễm vi khuẩn lạ, vi khuẩn A. xylinum phải ở dạng hoạt hĩa cĩ hình dạng và kích thước đặc trưng: tế bào cĩ dạng que hơi cong, hai đầu trịn hoặc dạng bầu dục dài.
- Hoạt hĩa lần thứ hai: giống vi khuẩn sau khi kiểm tra đạt tiêu chuẩn tinh khiết và hình dạng đặc trưng được tiếp tục hoạt hĩa lần thứ 2: cho giống vào mơi trường nhân giống mới theo tỷ lệ nhân giống là 1/10, nuơi cấy trong máy lắc ở nhiệt độ 30 oC trong 72 giờ.
- Đếm số vi khuẩn trong 1 ml mơi trường ban đầu, đến khi đạt được số lượng vi khuẩn khoảng 108 vi khuẩn/ml mơi trường, đây là giống đã hoạt hĩa được sử dụng cho giai đoạn nuơi cấy nhân giống với thể tích mơi trường lớn.
Giai đoạn nhân giống: vi khuẩn sau khi hoạt hĩa được cho vào mơi trường khảo sát và nuơi cấy động trên máy lắc. Sau các khoảng thời gian, xác định số lượng vi khuẩn trong 1 ml mơi trường nuơi cấy.
Khảo sát nguồn nitơ thích hợp cho quá trình nhân giống: khảo sát sự tăng trưởng của
A. xylinum với 2 nguồn nitơ là cao chiết nấm men và pepton từ thịt. Nuơi cấy vi khuẩn ở các nồng độ chất thử nghiệm khác nhau, xác định hiệu quả nuơi cấy tính bằng sinh khối thu được (số vi khuẩn / ml mơi trường nuơi cấy) và xử lý số liệu thống kê để đánh giá kết quả.
Khảo sát pH thích hợp cho quá trình tăng trưởng: pH mơi trường ảnh hưởng đáng kể đến sự tăng trưởng của vi khuẩn. Mỗi lồi cĩ một pH thích hợp nhất cho sự tăng trưởng. A. xylinum là vi khuẩn cĩ khả năng chịu được pH acid trong quá trình tăng
trưởng. Vì vậy cần khảo sát xác định pH thích hợp cho qui trình nhân giống A. xylinum. Nuơi cấy động vi khuẩn trong các mơi trường cĩ pH khác nhau: pH 4,5; 5,5 ; 6; 6,5; 7,5. Đánh giá hiệu quả nuơi cấy bằng sinh khối thu được.
Xác định thời gian thu sinh khối: sau khi xác định được mơi trường thích hợp,tiếp tục xác định lượng sinh khối vi khuẩn theo thời gian, từ đĩ xác định thời gian thu sinh khối tối ưu trong giai đoạn tăng sinh.
Khảo sát mơi trường, điều kiện lý hĩa quá trình nhân giống
Sơđồ 2.1. Các giai đoạn nhân giống
Đánh giá hiệu quả của quá trình nuơi cấy nhân giống: đánh giá bằng sinh khối vi khuẩn (số tế bào) thu được / ml mơi trường.
Phương pháp xác định số lượng vi khuẩn: sử dụng 2 phương pháp sau:
(1) Phương pháp đếm trực tiếp tế bào vi khuẩn dưới kính hiển vi: phương pháp sử dụng buồng đếm hồng cầu.
(2) Phương pháp đếm sống: đếm số lượng khuẩn lạc phát triển trên mơi trường thạch bằng phương pháp pha lỗng và trải bản thạch.
Sử dụng cả hai phương pháp để đánh giá sinh khối. Với phương pháp sử dụng buồng đếm hồng cầu cải tiến Neubauer cho kết quả nhanh chĩng, dùng để xác định tổng số vi khuẩn ở thời điểm ban đầu, sau đĩ kết quả được tiếp tục xác định bằng phương pháp đếm sống. Giống A. xylinum Hoạt hĩa lần 1 Hoạt hĩa lần 2 Thu hoạch giống A. xylinumđã hoạt hĩa Thu hoạch giống cho giai đoạn lên men
d. Các chỉ tiêu theo dõi
- Số lượng vi khuẩn / ml mơi trường nhân giống
- Mức độ nhiễm vi khuẩn lạ.