C. sinensis CsHB SLG nhỏ trưởng thành Hòa Bình (Việt Nam)
F. hepatica (multiplex-PCR) (1031bp) cox1-trnT-rrnL (16S)
3.2.7.1. Xây dựng và thử nghiệm bộ kit số 7( kit D(Tso+Tsa+Tas))
Kit multiplex-PCR phân biệt 3 loài sán dây (triplex-PCR), được ký hiệu là kit D(Tso+Tsa+Tas). Kit D(Tso+Tsa+Tas) được thử nghiệm trên sán dây lợn T. solium
(mẫu TsoN1b); sán dây bò T. saginata (mẫu TQN); và sán dây châu Á T. asiatica (mẫu TaN3) (liệt kê ở Bảng 2.1).
Sử dụng 4 mồi là TSOF/TSAF/TASF-TASSR, trong đó TSOF-TASSR (đặc hiệu
T. solium); TSAF-TASSR (đặc hiệu T. saginata); TASF-TASSR (đặc hiệu T. asiatica) cho một phản ứng multiplex-PCR, thử nghiệm với khuôn chung của hai (duplex-PCR) hay ba (triplex-PCR) giữa T. solium, T. saginata và T. asiatica, được hỗn hợp bằng cách trộn chung theo tỉ lệ bằng nhau.
Các khuôn chung được hỗn hợp như sau:
- Trộn khuôn chung 3 loài T. solium, T. saginata và T. asiatica
TsoN1b/TQN/TaN3: 10 µl (50 ng/µl) TsoN1b + 10 µl (50 ng/µl) TQN + 10 µl (50 ng/µl) TaN3.
54
- Trộn khuôn chung 2 loài T. saginata và T. solium: TQN/TsoN1b: 10 µl (50 ng/µl) TNS1 + 10 µl (50 ng/µl) TsoN1b.
- Trộn khuôn chung 2 loài T. asiatica và T. solium TaN3/TsoN1b: 10 µl (50 ng/µl) TaN3 + 10 µl (50 ng/µl) TsoN1b.
- Trộn khuôn chung 2 loài T. asiatica và T. saginata: TaN3/TQN: 10 µl (50 ng/µl) TaN3 + 3 µl (50 ng/µl) TQN.
Thực hiện phản ứng PCR với thành phần như trình bày ở Bảng 2.3 và chu trình nhiệt như ở Bảng 2.4; sau đó điện di trên thạch 1% để kiểm tra đánh giá sản phẩm của phản ứng (Hình 3.12A).
Hình 3.12A. Ảnh điện di kiểm tra phản ứng duplex- và triplex-PCR giữa 2 hoặc 3 loài sán dây T. solium, T.
saginata và T. asiatica bố trí với 4 mồi TSOF/TSAF/TASF-TASSR, trong đó TSOF-TASSR (đặc hiệu T. solium),
474 bp; TSAF-TASSR (đặc hiệu T. saginata), 629 bp; TASF-TASSR (đặc hiệu T. asiatica), 706 bp.Ghi chú: M. chỉ thị phân tử DNA của thực khuẩn thể Lambda được cắt bằng enzyme HindIII; Giếng 1: Hỗn hợp 2 khuôn chỉ thị phân tử DNA của thực khuẩn thể Lambda được cắt bằng enzyme HindIII; Giếng 1: Hỗn hợp 2 khuôn TsoN1b/TQN (2 loài: T. solium + T. saginata) (Tso+Tsa); Giếng 2: Hỗn hợp 2 khuôn TsoN1b/TaN3 (2 loài: T.
solium + T. asiatica) (Tso+Tas); Giếng 3: Hỗn hợp 2 khuôn TQN/TaN3 (2 loài: T. saginata + T. asiatica)
(Tsa+Tas); Giếng 4: Hỗn hợp 3 khuôn TsoN1b/TQN/TaN3 (3 loài: T. solium + T. saginata + T. asiatica) (Tso+Tsa+Tas).
Kết quảđiện di sản phẩm PCR ở Hình 3.12A cho thấy:
- Giếng 1 là hỗn hợp của 2 khuôn TsoN1b/TQN (2 loài: T. solium + T. saginata) (Tso+Tsa) được sử dụng 4 mồi, trong đó chỉ có 2 cặp mồi cho kết quả sản phẩm PCR
đặc hiệu cho mỗi loài là TSOF-TASSR (đặc hiệu T. solium), 474 bp; và TSAF-TASSR (đặc hiệu T. saginata), 629 bp;
- Giếng 2 gồm hỗn hợp 2 khuôn TsoN1b/TaN3 (2 loài: T. solium + T. asiatica) (Tso+Tas), được sử dụng 4 mồi, trong đó chỉ có 2 cặp mồi cho kết quả sản phẩm PCR
đặc hiệu cho mỗi loài là TSOF-TASSR (đặc hiệu T. solium), 474 bp; và TASF-TASSR (đặc hiệu T. asiatica), 706 bp;
- Giếng 3 gồm hỗn hợp 2 khuôn TQN/TaN3 (2 loài: T. saginata + T. asiatica) (Tsa+Tas), được sử dụng 4 mồi, trong đó chỉ có 2 cặp mồi cho kết quả sản phẩm PCR
M 1 2 3 44,3kb 4,3kb 2kb 564bp 706bp 629bp 474bp M 1 2 3 4 4,3kb 2kb 564bp 706bp 629bp 474bp
55
đặc hiệu cho mỗi loài là TSAF-TASSR (đặc hiệu T. saginata), 629 bp; và TASF- TASSR (đặc hiệu T. asiatica), 706 bp.
- Giếng 4 gồm hỗn hợp 3 khuôn TsoN1b/TQN/TaN3 (3 loài: T. solium + T. saginata + T. asiatica) (Tso+Tsa+Tas), được sử dụng 4 mồi, các cặp mồi đều cho kết quả sản phẩm PCR đặc hiệu cho mỗi loài là TSOF-TASSR (đặc hiệu T. solium), 474 bp; TSAF-TASSR (đặc hiệu T. saginata), 629 bp; và TASF-TASSR (đặc hiệu T. asiatica), 706 bp.
Như vậy, bộ kit triplex-PCR (3 cặp mồi, phát hiện 3 loài) đã được thử nghiệm thành công. Ởđây, bộ kit D(Tso+Tsa+Tas)được sử dụng 4 mồi là TSOF/TSAF/TASF- TASSR, trong đó chung mồi ngược TASSR, phân biệt giữa 3 loài sán dây lợn T. solium, sán dây bò T. saginata và sán dây châu Á T. asiatica.
Bên cạnh đó, phản ứng duplex-PCR (2 cặp mồi, phát hiện 2 loài) phân biệt giữa 2 loài sán dây T. solium + T. saginata (Tso+Tsa); 2 loài sán dây T. solium + T. asiatica
(Tso+Tas); 2 loài sán dây T. saginata + T. asiatica (Tsa+Tas) được sử dụng cả 4 mồi TSOF/TSAF/TASF-TASSR, cũng đã được thử nghiệm thành công.
3.2.7.2.Giải trình tự kiểm tra chuỗi gen của sản phẩm
T. solium
CTAGGCCACTTAGTAGTTTAGTTAAAATGATTATTTTTGGGTTTATTAGTGGTTTTATGGGTTTGTTAATTTGTTTATTAATTATAGCTTTTTTT
ATATTAGGGGAACGTAAGATTTTGGGTTATTCTCAATTTCGTAAGGGTCCTAATAAGGTTGGTATTGTAGGATTGTTACAAAGGTTTTCTGATTT
ATTAAAGTTGATAATTAAGTTTAAGAATTGTGGATTTCAGAGTCGTAGTTGAGTTGGTTTGTTTGGGGTTATGTTGTTGGTTAGTTTAGTTATTT
ATTATTCATTTGTATATGGTGGTTATTATAGGTATAGGTTTAATTCTCTTTCTTTGTTATGGTTTTTGGTTATAACTAGATTTTGTAGTTATTCG
ATATTATGTACGGGTTGAGGTAGTTATAAAAGTTATTCGTTTTTAAGTTCAATTCGTTGTGCTTTTAGGTCTATAAGGTTTGAGGCTTGTTTTA
T. saginata
ACTACATTTGGTTTGTTTTTGTAGAAACAAAATAGTTTAATTAAAAATATTGGGTTTGCGTCTCGAAGATGGATTGTAGTTTCTTTTGTTATAGA
TAGATAATGGTGTGTGGCTTTAGTTTAATGAAAATGGTGATTTGTCTAGTCATAGATGGTAGTTTAATAACCAAGTCGCTTATTTATGATTATTT
TTGGGTTTATTAGTGGTTTAACAGGTTTGTTAGTTAGTTTATTGATTATAGCTTTTTTTATTTTGGGAGAGCGTAAGATTTTGGGTTATTCTCAG
TTTCGTAAGGGTCCTAAAAAGGTTGGTATTATTGGGTTGCTTCAGAGATTTTCTGATTTGTTGAAGTTAATAGTTGAGTTTAAGAATTATGGTTT
TCAAAGTCGTAGATGAGTTGGTTTATTTGGAGTTGTATTATTGGTTGGTTTAGTTATTTATTATTCGTTCGTGTATGGTGGTTATTATAGGTATA
GTTTTAATTCATTGTCTCTATTATGGTTTTTGGTTATTACCAGATTTTGTAGTTATTCTATATTGTGTACAGGTTGGGGTAGTTATAAAAGTTAT
TCGTTTTTAAGTTCAATTCGTTGTGCTTTTGGATCTATAAGGTTTGAGGCTTGTTTTAT
T. asiatica
GGGTTTAAGTTATAAATGTGATGTAGTTTATTTAAAATACTTGTTTTACACTCAGGAGAACTCTTTATGTGGAGCTTTACTATGTGTTCGTTTTT
TGTATAAACAAAATAGTTTAATTAAAAATATTGGGTTTGCGTCTCGAAGATGGGTTGTAATTTCTTTTGTTATAAGTATATAACGGTGGTGTGGC
TTTAGTTTAATGAAAATGATGATTTGTCTAGTCATAGATGGTAGTTTAGTAATCAAGTCGCTTGTATATGATTATTTTTGGGTTTGTCAGTGGTT
TGACAGGTTTGTTAGTTAGCTTGTTGATTATAGCTTTTTTTATTTTGGGAGAGCGTAAGATTTTGGGTTATTCTCAGTTTCGTAAGGGTCCTAAA
AAGGTTGGTATTATTGGGTTGCTTCAGAGATTTTCTGATTTGTTAAAGTTGATAGTTAAGTTTAAGAATTATGGTTTTCAAAGTCGTAGATGAGT
TGGTTTATTTGGAGTTGTATTGTTGGTTGGTTTAGTTATTTATTATTCGTTTGTGTATGGTGGTTATTATAGATATAGTTTTAATTCACTGTCTC
TATTATGATTTTTGGTTATTACTAGGTTTTGTAGTTACTCCATACTATGTACAGGTTGGGGTAGTTATAAAAGTTATTCGTTTTTAAGTTCAATT
CGTTGTGCTTTTGGATCTATAAGGTTTGAGGCTTGTTTTAT
Hình 3.12B. Trình tự chuỗi nucleotide của đoạn gen sản phẩm từT. solium (474 bp), từ T. saginata
(629 bp) và từT. asiatica (706 bp), được giải trình tựđể xác định sản phẩm đặc hiệu loài của phản ứng triplex PCR. Chuỗi nucleotide ngắn ở mỗi đầu là ứng với các chuỗi mồi TSOF/TASSR (T. solium), TSAF/TASSR (T. saginata), và TASF/TASSR (T. asiatica).
DNA sản phẩm duplex-PCR ở giếng 4 trên Hình 3.12A, được phân lập khỏi thạch agarose bằng bộ sinh phẩm AccuPrep Gel Purification Kit (Bioneer, Hàn Quốc), tinh sạch và gửi đi giải trình tự. Sử dụng mồi TSOF cho sản phẩm của T. solium (độ dài
56
474 bp), mồi TSAF cho sản phẩm của T. saginata (độ dài 629 bp) và mồi TSAF cho sản phẩm của T. asiatica (706 bp). Chuỗi nucleotide thu nhận được trình bày ở Hình 3.12B.
