C. sinensis CsHB SLG nhỏ trưởng thành Hòa Bình (Việt Nam)
F. hepatica (multiplex-PCR) (1031bp) cox1-trnT-rrnL (16S)
3.2.8.1 Xây dựng và thử nghiệm bộ kit số 8 (bộ kit E(Ph+Po))
Do không có nguồn khuôn sán lá phổi P. westermani, chúng tôi sử dụng P. ohirai (do phía Nhật Bản cung cấp) để xây dựng kit chẩn đoán phân biệt 2 loài sán lá phổi thường gặp ở châu Á là P. heterotremus và P. ohirai.
250bp 500bp 750bp 1kb 706bp 629bp 474bp M 1 2 3 4 5 6 7 250bp 500bp 750bp 1kb 706bp 629bp 474bp M 1 2 3 4 5 6 7 250bp 500bp 750bp 1kb 706bp 629bp 474bp M 1 2 3 4 5 6 7 250bp 500bp 750bp 1kb 706bp 629bp 474bp M 1 2 3 4 5 6 7
59
Hình 3.13A: Ảnh điện di kiểm tra phản ứng duplex-PCR phân biệt giữa sán lá phôi P. heterotremus và
P. ohirai (bộ kit E(Ph+Po)), thực hiện với 2 cặp mồi PHEF-PHOWR và POHF-PHOWR. Ghi chú: M. chỉ thị phân tử DNA 1 kb (Fermentas Inc.). Giếng 1. Mẫu khuôn PhVN, với 2 cặp mồi trên (sản phẩm chỉ thị phân tử DNA 1 kb (Fermentas Inc.). Giếng 1. Mẫu khuôn PhVN, với 2 cặp mồi trên (sản phẩm 598 bp); Giếng 2. Mẫu khuôn PoJP với 2 cặp mồi trên (sản phẩm 433 bp); Giếng 3. Hỗn hợp khuôn PhVN/PoJP với cặp mồi PHEF-PHOWR của P. heterotremus (sản phẩm 598 bp); Giếng 4. Hỗn hợp khuôn PhVN/PoJP với cặp mồi POHF-PHOWR P. ohirai. Giếng 5. Hỗn hợp khuôn PhVN/PoJP với 2 cặp mồi trên (sản phẩm 598 bp và 433 bp của cả hai loài).
Kit multiplex-PCR phân biệt hai loài sán lá phổi P. heterotremus và P. ohirai
(duplex-PCR), được ký hiệu là kitE(Ph+Po). Kit E(Ph+Po) được thử nghiệm trên sán lá gan phổi P. heterotremus (mẫu PhVN) và P. ohirai (mẫu PoJP) (liệt kê ở Bảng 2.1).
Khuôn chung giữa 2 loài P. heterotremus và P. ohirai được hỗn hợp bằng cách pha chung theo tỉ lệ 1:1 và sử dụng các cặp mồi đặc hiệu PHEF-PHOWR (đặc hiệu P. heterotremus) và POHF-PHOWR (đặc hiệu P. ohirai), sử dụng chung mồi ngược PHOWR (đặc hiệu cho cả hai loài), cho một phản ứng multiplex-PCR, tức là sử dụng 3 mồi để phát hiện 2 loài (Bảng 2.2).
Thực hiện giả nghiệm với khuôn chung PhVN/PoJP, được pha như sau: 10 µl (50 ng/µl) PhVN + 10 µl (50 ng/µl) PoJP.
Thực hiện phản ứng duplex-PCR với thành phần như trình bày ở Bảng 2.3 và chu trình nhiệt nhưở Bảng 2.4; sau đó điện di trên thạch 1% để kiểm tra đánh giá sản phẩm của phản ứng (Hình 3.13A).
Kết quảđiện di sản phẩm ở Hình 3.13A cho thấy:
- Khi sử dụng khuôn đơn của từng loài, mặc dù có cả 2 cặp mồi PHEF-PHOWR (đặc hiệu P. heterotremus) và POHF-PHOWR (đặc hiệu P. ohirai), nhưng khi điện di trên thạch agarose 1% (nhuộm ethidium bromide), chỉ thấy xuất hiện một băng DNA có
độ dài tương ứng đặc hiệu riêng với mỗi loài, đó là hoặc 598 bp của P. heterotremus
250 bp 500 bp 750 bp 1 kb M 1 2 3 4 5 598 bp 433 bp 250 bp 500 bp 750 bp 1 kb M 1 2 3 4 5 598 bp 433 bp
60
(giếng 1, với khuôn PhVN) hoặc 433 bp của P. ohirai (giếng 2, với khuôn PoJP) (Hình 3.13A).
- Khi sử dụng khuôn hỗn hợp của hai loài (trộn khuôn PhVN/PoJP của 2 loài), nhưng chỉ sử dụng một cặp mồi đặc hiệu của mỗi loài, mặc dù có DNA khuôn của cả 2 loài (PhVN/PoJP), nhưng khi điện di trên thạch agarose 1% (nhuộm ethidium bromide), chỉ thấy xuất hiện một băng DNA có độ dài tương ứng đặc hiệu riêng với loài có cặp mồi đặc hiệu hoạt động, đó là hoặc 598 bp của P. heterotremus (giếng 3, với cặp mồi PHEF-PHOWR) hoặc 433 bp của P. ohirai (giếng 4, với cặp mồi POHF-PHOWR) (Hình 3.13A).
- Khi sử dụng khuôn hỗn hợp của hai loài (trộn khuôn PhVN/PoJP của 2 loài), với 2 cặp mồi PHEF-PHOWR và POHF-PHOWR, khi điện di trên thạch agarose 1% (nhuộm ethidium bromide), kết quả tại giếng 5 cho thấy, xuất hiện cùng lúc 2 băng DNA sản phẩm, một băng có kích thước 598 bp của P. heterotremus và một băng có kích thước 433 bp của P. ohirai, tương ứng với sản phẩm của các cặp mồi đặc hiệu của các loài có trong phản ứng (Hình 3.13A).
Như vậy, bộ kit duplex-PCR (multiplex-PCR 3 mồi, phát hiện hai loài) đã được thử nghiệm thành công. Ở đây, bộ kit E(Ph+Po) được sử dụng 2 cặp mồi là PHEF- PHOWR và POHF-PHOWR, trong đó chung mồi ngược PHOWR, phân biệt giữa 2 loài sán lá phổi P. heterotremus và P. ohirai.
3.2.8.2.Giải trình tự kiểm tra chuỗi gen của sản phẩm P. heterotremus GGTTCTGTTTTGAGGTCAAAATCAATAGATTTTTGGTAGTTGAGCCTAGTGGTTGGGTCTTGGTTTTTGAGGTAACTCAGATTGGGCTGTTTTAA TTGGGGTGGATAGTTCGCAGTGCCAGCATCCGCGGTTATTCTGTTAATCCCCTCTTCTGTTTGGTTTAAACGTTTTGTAGGGTATTCTGACTTTT GGGTAGAATTCTTGTCTTGTTGAGATATGCCTACATTTCTTGGAGTGTTTTTTAGGAAAAGGATTAGAGACCCTTGTACTAGGTGGAGTATTTTG TGTCCATGGTGTAAACTAAAAGGATTTGGCAGCCGATGAGGTTCTTCCGGGGGAGTGTGTGGTTTAAGAGATAGTCCGCTTAGGATCTTGCCGCC GCTATTAGTTAGTGTATATCCGGTTTAAGATTCGTGATTTGTGTCATTGAGTGTCATTTTGTTTTAATTGAATCCAGGTCAATGTGCTGCTTATG CGGTGGTGCTTATGCACTACTTTTAAAAGGTTCCTTGGTGTAATCTGGGGAGGTTTAGGACTCGGAAGTAGGTGGATTGAGGTTTGTTCTATCGA ATGTTGGATTTAGTTGGGGTACATACCG P. ohirai ATGATTTGCAGGAGATTTCGGACTTTTGGGTAGAATTGTTGTCTTGTTGAGAAACACTTGCATTTTTTTGGAGAACTCTCTAGGAAAAGGATTAG AGACCCTTGTACTGAGTGGAGTATTTTGTGGCCATGGTGTAAACTAAAAGGATTTGGCAGCCGATGATGTTCCTCCGGGGGAGTGTGTGGCGTAA GAGATAGTCCACTTAGGATCTTACCATCATTATTAGTTAGTGTATATCCGGTTTAAGATTCGTGATTTGTGTCATTGAGTGTTATTGATTTAATT GAATCCAGGTCAATGTGCTGCTTATGTGATGGTGCTTGTGCACTACTTTTTGAATATTCTTCAATGTAAATTGTGGGAGGTTTAGGACTCGGAAG TAGGCGGATTGAGGTTTGTTCTGTCGAATTTGGATTTAGTTGGGGTACATACC
Hình 3.13B. Trình tự chuỗi nucleotide của đoạn gen sản phẩm từ P. heterotremus (598 bp) và từ P. ohirai (433 bp), được giải trình tựđể xác định sản phẩm đặc hiệu loài của phản ứng duplex PCR. Chuỗi nucleotide ngắn ở mỗi đầu là ứng với các chuỗi mồi PHEF/PHOWR (P. heterotremus) và POHF/PHOWR (P. ohirai).
DNA sản phẩm duplex-PCR ở giếng 5 trên Hình 3.13A, được phân lập khỏi thạch agarose bằng bộ sinh phẩm AccuPrep Gel Purification Kit (Bioneer, Hàn Quốc), tinh sạch và gửi đi giải trình tự. Sử dụng mồi PHEF cho sản phẩm của P. heterotremus
61
(độ dài 598 bp) và mồi POHF cho sản phẩm của P. ohirai (độ dài 433 bp). Chuỗi nucleotide thu nhận được trình bày ở Hình 3.13B.