C. sinensis CsHB SLG nhỏ trưởng thành Hòa Bình (Việt Nam)
P. heterotremus PhVN SLP trưởng thành Lai Châu
3.2.2.1. Xây dựng và thử nghiệm bộ kit số 2 (bộ kit B(Fg+Fh))
Kit multiplex-PCR phân biệt hai loài sán lá gan lớn F. gigantica và F. hepatica
(duplex-PCR), được ký hiệu là kitB(Fg+Fh). Kit B(Fg+Fh) được thử nghiệm trên sán lá gan lớn F. gigantica (mẫu FspT4V) và F. hepatica (mẫu FhAUS) (liệt kê ở Bảng 2.1).
35
Hình 3.7A. Ảnh điện di kiểm tra phản ứng duplex-PCR giữa F. gigantica và F. hepatica (bộ kit
B(Fg+Fh)) sử dụng 2 cặp mồi FGF-FHGR và FHF-FHGR. Ghi chú: M. chỉ thị phân tử DNA của thực khuẩn thể Lambda được cắt bằng enzyme HindIII; Giếng 1. mẫu FspT4V (sản phẩm 615 bp); Giếng 2. Mẫu FhAUS (sản phẩm 1031 bp); Giếng 3. Hỗn hợp khuôn FspT4V/FhAUS (sản phẩm 615 bp và 1031 bp).
Khuôn chung giữa 2 loài F. gigantica và F. hepatica được hỗn hợp bằng cách pha chung theo tỉ lệ 1:1 và sử dụng các cặp mồi đặc hiệu FGF-FHGR (đặc hiệu F. gigantica) và FHF-FHGR (đặc hiệu F. hepatica) cho một phản ứng multiplex-PCR, tức là sử dụng 3 mồi để phát hiện 2 loài (Bảng 2.2).
Thực hiện giả nghiệm với khuôn chung FspT4V/FhAUS, được pha như sau: 10 µl (50 ng/µl) FspT4V + 10 µl (50 ng/µl) FhAUS.
Thực hiện phản ứng PCR với thành phần như trình bày ở Bảng 2.3 và chu trình nhiệt như ở Bảng 2.4; sau đó điện di trên thạch 1% để kiểm tra đánh giá sản phẩm của phản ứng (Hình 3.7A).
Kết quảở Hình 3.7A cho thấy:
- Khi sử dụng khuôn đơn của từng loài, mặc dù có cả 2 cặp mồi FGF-FHGR và FHF-FHGR, nhưng khi điện di trên thạch agarose 1% (nhuộm ethidium bromide), chỉ
thấy xuất hiện một băng DNA có độ dài tương ứng đặc hiệu riêng với mỗi loài, đó là hoặc 615 bp của F. gigantica (giếng 1) hoặc 1031 bp của F. hepatica (giếng 2) (Hình 3.7A).
- Khi sử dụng khuôn hỗn hợp của hai loài (trộn khuôn của 2 loài), với 2 cặp mồi FGF-FHGR và FHF-FHGR, khi điện di trên thạch agarose 1% (nhuộm ethidium bromide), kết quả tại giếng 3 (khuôn trộn FspT4V/FhAUS) cho thấy, xuất hiện cùng lúc 2 băng DNA sản phẩm, một băng có kích thước 615 bp của F. gigantica và một băng có kích thước 1031 bp của F. hepatica, tương ứng với sản phẩm mỗi cặp mồi đặc hiệu của mỗi loài có trong phản ứng (Hình 3.7A).
M 1 2 32kb 2kb 564bp 1031bp 615bp M 1 2 3 2kb 564bp 1031bp 615bp
36
Như vậy, bộ kit duplex-PCR (multiplex-PCR 3 mồi, phát hiện hai loài) đã được thử nghiệm thành công. Ởđây, bộ kit B(Fg+Fh) được sử dụng 2 cặp mồi là FHF-FHGR và FGF-FHGR, trong đó chung mồi ngược FHGR, phân biệt giữa 2 loài sán lá gan lớn
F. gigantica và F. hepatica.
3.2.2.2.Giải trình tự kiểm tra chuỗi gen của sản phẩm
DNA sản phẩm duplex-PCR ở giếng 3 (Hình 3.7A) được phân lập khỏi thạch agarose bằng bộ sinh phẩm AccuPrep Gel Purification Kit (Bioneer, Hàn Quốc), tinh sạch và gửi đi giải trình tự. Sử dụng mồi FHF cho sản phẩm của F. hepatica (độ dài 1031 bp) và mồi FGF cho sản phẩm của F. gigantica (độ dài 1031 bp). Chuỗi nucleotide thu nhận được trình bày ở Hình 3.7B.