C. sinensis CsHB SLG nhỏ trưởng thành Hòa Bình (Việt Nam)
3.2.1.1.Xây dựng và thử nghiệm bộ kit số 1 (kit A(Cs+Ov))
P. heterotremus PhVN SLP trưởng thành Lai Châu
3.2.1.1.Xây dựng và thử nghiệm bộ kit số 1 (kit A(Cs+Ov))
Kit multiplex-PCR phân biệt hai loài sán lá gan nhỏ C. sinensis và O. viverrini
(duplex-PCR), được ký hiệu là kit A(Cs+Ov). Kit A(Cs+Ov) đượcthử nghiệm trên sán lá gan nhỏ C. sinensis (mẫu CsHB, CsND) và O. viverrini (mẫu OvBD, OvQT) (liệt kê
ở Bảng 2.1).
Khuôn chung giữa 2 loài C. sinensis và O. viverriniđược hỗn hợp bằng cách pha chung theo tỉ lệ 1:1 và sử dụng các cặp mồi đặc hiệu CsF-CsR (đặc hiệu C. sinensis) và Ov5F-OvN3R (đặc hiệu O. viverrini) cho một phản ứng multiplex-PCR, tức là sử dụng 4 mồi để phát hiện 2 loài (Bảng 2.2).
Thực hiện giả nghiệm với khuôn chung , được pha như sau:
- Pha khuôn chung CsHB/OvBD: 10 µl (50 ng/µl) CsHB + 10 µl (50 ng/µl) OvBD. - Pha khuôn chung CsND/OvQT: 10 µl (50 ng/µl) CsND + 10 µl (50 ng/µl) OvQT.
Thực hiện phản ứng PCR với thành phần như trình bày ở Bảng 2.3 và chu trình nhiệt như ở Bảng 2.4; sau đó điện di trên thạch 1% để kiểm tra đánh giá sản phẩm của phản ứng (Hình 3.6).
Hình 3.6A. Ảnh điện di kiểm tra kết quả phản ứng duplex-PCR giữa C. sinensis và O. viverrini (bộ kit
A(Cs+Ov)) sử dụng 2 cặp mồi CsF-CsR và Ov5F-OvN3R. Ghi chú: M. chỉ thị phân tử DNA của thực khuẩn thể Lambda được cắt bằng enzyme HindIII; Giếng 1. mẫu CsHB (sản phẩm 489 bp); Giếng 2. mẫu OvBD (sản phẩm 818 bp); Giếng 3. mẫu OvQT (sản phẩm 818 bp); Giếng 4. Hỗn hợp khuôn CsHB/OvBD (sản phẩm 489 bp và 818 bp); Giếng 5. Hỗn hợp khuôn CsND/OvQT (sản phẩm 489 bp và 818 bp). M 1 2 3 4 5 564bp 818bp 489bp 2kb 4.4kb M 1 2 3 4 5 564bp 818bp 489bp 2kb 4.4kb
32
Kết quảở Hình 3.6A cho thấy:
- Khi sử dụng khuôn đơn của từng loài, mặc dù có cả 2 cặp mồi CsF-CsR và Ov5F-OvN3R, nhưng khi điện di trên thạch agarose 1% (nhuộm ethidium bromide), chỉ
thấy xuất hiện một băng DNA có độ dài tương ứng đặc hiệu riêng với mỗi loài, đó là hoặc 489 bp của C. sinensis (giếng 1) hoặc 818 bp của O. viverrini (giếng 2, 3) (Hình 3.6A).
- Khi sử dụng khuôn hỗn hợp của hai loài (trộn khuôn của 2 loài), với 2 cặp mồi CsF-CsR và Ov5F-OvN3R, khi điện di trên thạch agarose 1% (nhuộm ethidium bromide), kết quả tại giếng 4 (khuôn trộn CsHB/OvBD) cũng như giếng 5 (khuôn trộn CsND/OvQT), cho thấy cả 2 giếng đều xuất hiện cùng lúc 2 băng DNA sản phẩm, một băng có kích thước 818 bp (của loài O. viverrini) và một băng có kích thước 489 bp (của loài C. sinensis) tương ứng với sản phẩm mỗi cặp mồi đặc hiệu của mỗi loài có trong phản ứng (Hình 3.6A).
Như vậy, bộ kit duplex-PCR (multiplex-PCR hai cặp mồi, phát hiện hai loài) đã
được thử nghiệm thành công. Ở đây, bộ kit A(Cs+Ov), sử dụng 2 cặp mồi là CsF-CsR và Ov5F-OvN3R phân biệt giữa 2 loài sán lá gan nhỏC. sinensis và O. viverrini.
3.2.1.2. Giải trình tự kiểm tra chuỗi gen của sản phẩm
DNA sản phẩm duplex-PCR ở giếng 5 (Hình 3.6A) được phân lập khỏi thạch agarose bằng bộ sinh phẩm AccuPrep Gel Purification Kit (Bioneer, Hàn Quốc), tinh sạch, và gửi đi giải trình tự. Sử dụng mồi CsF cho sản phẩm của C. sinensis (băng có độ
dài 489 bp) và mồi Ov5F cho sản phẩm của O. viverrini (băng có độ dài 818 bp). Chuỗi nucleotide thu nhận được trình bày ở Hình 3.6B.
C. sinensis ATACCTTTGCGTGGTGGGAGGAGAGATAAGTTAAGTTGAATAAACTGTGTGATTCATGCTCATAAAATACGTTTTTCGTTTTCTCCTATGTTTGT ATACCTTTGCGTGGTGGGAGGAGAGATAAGTTAAGTTGAATAAACTGTGTGATTCATGCTCATAAAATACGTTTTTCGTTTTCTCCTATGTTTGT TTCTCGTTTGTTTGGGGTGTTTGATTATTTCTCTTTGATAATCCGAGGTGGGTTGTGTAGACCTTTTTATCGTTTGTCTTTATTTTTGTTGCTTG GGGGGTTTTTAAGGTTGCGCTTGCCTTATGTTTACGGTATGGGAGGTTTTGTTCTGTTTATTTTTTTTATTGTGTGTCCGTTGTTTTGTGGCCTT TTTTTTTCTCGGGTGCTAGATGGGGGTTTGAGTTGTTTTGTTTCATGCTTTGTGCCGATGGGTACTCCACTTTGGATAGCTCCATTTGTTTGTTT GGCCGAAACACTCAGTTATATTGTTCGTCCTGGTGTTTTAATGATGCGTCCTTTCGTTAAATTGTCTGCTGGTGCGTTAGGAGGTTACGCATTGG GCTTGTTGAGTATG O. viverrini TACGCAGGTGGTTTGGTTGGTTAGGCGTTTTTTTTTTGATTTTTTTAGCTTGCTGTTATTGCTTGGTGATGTGTATGTCCTATGATGGGGGTTGC AATTCGGTGATGCTTTTATGACTTCTCTTAGGGACTAGGTTAACGGGTTATAGTGTGTTGAGTATCGGTTGGGGTTCGTATAATAAGTTTGCTTT AATTAGATGTGTGCGTTCTGCATTCAGTTCTGTGACCTTTGAGGCTTGTTTTATGTGTGTAATTGTAATTTGTGCTTTGGTGTGCGGAAATTATG GATCTTTTGTGCTGCTGGAGGAGTTTTGAGGGGTGGGTTTAGTTGTACCCGTGTGTTATGTCGTGTGACTGGTTGGTATGCTTTGTGAGTGTAAT CGTACTCCGTTAGATTACGCAGAAGCGGAGAGGGAGCTAGTGAGCGGTTTAAGAACTGAGTATTGTAACGTTCCATTTACTTGTCTTTTTGCTTG TGAATATCTTATAATGTTTATTTTTTCCTGGTTAGGTTCAGTTCTGTTTTTCGGGGGGGATGTTGTTATTTGGGTTGGTTTGCTTCATGTGGTTT TTTTTATCTGGGCTCGTGCTACTCTTCCTCGAGTGCGTTATGACTATTTTATCGAGTTTATGTGAAAGTATTCTATTATGATACTGATTTTTTCT GTCTTTGTTGTTGTTTAGGGTAGGTACGGGTAGATTATGATAATTAAATCGTTAGGCTGTTAACCTTGCGAAGGCTGTATAGCCCCCGAGCGTAG CAATTTAGTAGTCTAACAAGGATGTGAGCTTTGGGAGTTCGTGGTCTCTTTATTGAGC
Hình 3.6B. Trình tự chuỗi nucleotide của đoạn gen sản phẩm từC. sinensis (489 bp) và từO. viverrini
(818 bp) được giải trình tự để xác định sản phẩm đặc hiệu loài của phản ứng duplex PCR. Chuỗi nucleotide ngắn ở mỗi đầu là ứng với chuỗi mồi CsF/CsR (C. sinensis) và Ov5F/ Ov13R (O. viverrini).
33