C. sinensis CsHB SLG nhỏ trưởng thành Hòa Bình (Việt Nam)
F. hepatica (multiplex-PCR) (1031bp) cox1-trnT-rrnL (16S)
3.2.6.1. Xây dựng và thử nghiệm bộ kit số 6 (bộ kit BC(Fh+Fg+Hp+Ht)
Kit multiplex-PCR phân biệt 4 loài sán lá gan lớn và sán lá ruột nhỏ, F. hepatica, F. gigantica, H. taichui và H. pumilio (quadruplex-PCR), được ký hiệu là kit BC(Fh+Fg+Ht+Hp). Kit BC(Fh+Fg+Ht+Hp) được thử nghiệm trên sán lá gan lớn F. hepatica (mẫu FhAUS); F. gigantica (mẫu FspT4V); và sán lá ruột nhỏH. taichui (mẫu HtYB) và H. pumilio (mẫu HpPT) (liệt kê ở Bảng 2.1).
Sử dụng 4 cặp mồi là FHF-FHGR (đặc hiệu F. hepatica); FGF-FHGR (đặc hiệu F. gigantica); HTAF-HTAR (đặc hiệu H. taichui); và HPUF-HPUR (đặc hiệu H. pumilio) cho một phản ứng multiplex-PCR, thử nghiệm với khuôn chung của ba (triplex-PCR)
50
hoặc bốn loài (quadruplex-PCR) giữa F. hepatica, F. gigantica, H. taichui và H. pumilio được hỗn hợp bằng cách trộn chung theo tỉ lệ bằng nhau.
Hình 3.11A. Ảnh điện di kiểm tra phản ứng triplex- và quadruplex-PCR giữa 3 hoặc 4 loài F. hepatica, F. gigantica, H. taichui và H. pumilio bố trí với 3 hay 4 căp mồi FHF-FHGR (đặc hiệu F. hepatica), 1031 bp; FGF-FHGR (đặc hiệu F. gigantica), 615 bp; HTAF-HTAR (đặc hiệu H. taichui), 250 bp; và HPUF-HPUR (đặc hiệu H. pumilio), 400 bp.Ghi chú: M. chỉ thị phân tử DNA 1 kb (Fermentas Inc.); Giếng 1: Hỗn hợp 4 khuôn FhAUS/FspT4V/HtYB/HpPT (Fh+Fg+Ht+Hp); Giếng 2: Hỗn hợp 3 khuôn FspT4V/HtYB/HpPT (Fg+Ht+Hp); Giếng 3: Hỗn hợp 3 khuôn FhAUS/HtYB/HpPT (Fh+Ht+Hp).
Các khuôn chung được hỗn hợp như sau:
- Trộn khuôn chung 4 loài: FhAUS/FspT4V/HtYB/HpPT: 10 µl (50 ng/µl) FhAUS + 10 µl (50 ng/µl) FspT4V + 10 µl (50 ng/µl) HtYB + 10 µl (50 ng/µl) HpPT (F. hepatica, F. gigantica, H. taichui và H. pumilio).
- Trộn khuôn chung 3 loài FhAUS/HtYB/HpPT: 10 µl (50 ng/µl) FhAUS + 10 µl (50 ng/µl) HtYB + 10 µl (50 ng/µl) HpPT (F. hepatica, H. taichui và H. pumilio).
- Trộn khuôn chung 3 loài FspT4V/HtYB/HpPT: 10 µl (50 ng/µl) FspT4V + 10 µl (50 ng/µl) HtYB + 3 µl (50 ng/µl) HpPT (gồm: F. gigantica, H. taichui và H. pumilio).
Thực hiện phản ứng PCR với thành phần như trình bày ở Bảng 2.3 và chu trình nhiệt như ở Bảng 2.4; sau đó điện di trên thạch 1% để kiểm tra đánh giá sản phẩm của phản ứng (Hình 3.11A).
Kết quảđiện di sản phẩm PCR ở Hình 3.11A cho thấy:
- Giếng 1 là hỗn hợp của 4 khuôn FhAUS/FspT4V/HtYB/HpPT (Fh+Fg+Ht+Hp) được sử dụng 4 cặp mồi, mỗi cặp mồi cho kết quả sản phẩm PCR đặc hiệu cho mỗi loài là FHF-FHGR (đặc hiệu F. hepatica), 1031 bp; FGF-FHGR (đặc hiệu
F. gigantica), 615 bp; HTAF-HTAR (đặc hiệu H. taichui), 250 bp; và HPUF-HPUR (đặc hiệu H. pumilio), 400 bp; M 1 2 3 250bp 500bp 750bp1kb 250bp400bp 615bp 1031bp M 1 2 3 250bp 500bp 750bp1kb 250bp400bp 615bp 1031bp
51
- Giếng 2 gồm hỗn hợp 3 khuôn FspT4V/HtYB/HpPT (Fg+Ht+Hp) được sử
dụng 3 cặp mồi, mỗi cặp mồi cho kết quả sản phẩm PCR đặc hiệu cho mỗi loài là FGF- FHGR (đặc hiệu F. gigantica), 615 bp; HTAF-HTAR (đặc hiệu H. taichui), 250 bp; và HPUF-HPUR (đặc hiệu H. pumilio), 400 bp;
- Giếng 3 là hỗn hợp 3 khuôn FhAUS/HtYB/HpPT (Fh+Ht+Hp) được sử dụng 3 cặp mồi, mỗi cặp mồi cho kết quả sản phẩm PCR đặc hiệu cho mỗi loài là FHF-FHGR (đặc hiệu F. hepatica), 1031 bp; HTAF-HTAR (đặc hiệu H. taichui), 250 bp; và HPUF- HPUR (đặc hiệu H. pumilio), 400 bp.
Như vậy, bộ kit quadruplex-PCR (4 cặp mồi, phát hiện 4 loài) đã được thử
nghiệm thành công. Ởđây, bộ kit BC(Fh+Fg+Ht+Hp)được sử dụng 4 cặp mồi là FHF- FHGR, FGF-FHGR, HTAF-HTAR và HPUF-HPUR phân biệt giữa 4 loài sán lá gan lớn và sán lá ruột nhỏ là F. hepatica, F. gigantica,H. taichui và H. pumilio.
Bên cạnh đó, phản ứng triplex-PCR (3 cặp mồi, phát hiện 3 loài) cũng đã được thử nghiệm thành công. Ở đây, các bộ kit triplex-PCR, tạm kí hiệu là
FhHH(Fh+Ht+Hp) được sử dụng 3 cặp mồi là FHF-FHGR, HTAF-HTAR và HPUF- HPUR phân biệt giữa 3 loài sán lá gan lớn và sán lá gan ruột nhỏF. hepatica; H. taichui
và H. pumilio; và bộ kit triplex-PCR, tạm kí hiệu là FgHH(Fg+Ht+Hp) được sử dụng 3 cặp mồi là FGF-FHGR, HTAF-HTAR và HPUF-HPUR phân biệt giữa 3 loài sán lá gan lớn và sán lá gan ruột nhỏF. gigantica,H. taichui và H. pumilio.