C. sinensis CsHB SLG nhỏ trưởng thành Hòa Bình (Việt Nam)
3.2.5.1.Xây dựng và thử nghiệm bộ kit số 5 (kit AC(Cs+Ov+Hp+Ht)
F. hepatica (multiplex-PCR) (1031bp) cox1-trnT-rrnL (16S)
3.2.5.1.Xây dựng và thử nghiệm bộ kit số 5 (kit AC(Cs+Ov+Hp+Ht)
Kit multiplex-PCR phân biệt 4 loài sán lá gan nhỏ và sán lá ruột nhỏ, C. sinensis, O. viverrini, H. taichui và H. pumilio (quadruplex-PCR), được ký hiệu là kit AC(Cs+Ov+Ht+Hp). Kit AC(Cs+Ov+Ht+Hp) đượcthử nghiệmtrên sán lá gan nhỏC. sinensis (mẫu CsND); O. viverrini (mẫu OvBD); và sán lá ruột nhỏ H. taichui (mẫu HtYB) và H. pumilio (mẫu HpPT) (liệt kê ở Bảng 2.1).
Sử dụng 4 cặp mồi là CsF-CsR (đặc hiệu C. sinensis); OV5F-OVN3R (đặc hiệu O. viverrini); HTAF-HTAR (đặc hiệu H. taichui); và HPUF-HPUR (đặc hiệu H. pumilio) cho một phản ứng multiplex-PCR, thử nghiệm với khuôn chung của ba (triplex-PCR) hoặc bốn loài (quadruplex-PCR) giữa C. sinensis; O. viverrini; H. taichui và H. pumilio
46
Các khuôn chung được hỗn hợp như sau:
- Trộn khuôn chung 4 loài: CsND/OvBD/HtYB/HpPT: 10 µl (50 ng/µl) CsND + 10 µl (50 ng/µl) OvBD + 10 µl (50 ng/µl) HtYB + 10 µl (50 ng/µl) HpPT (C. sinensis,
O. viverrini, H. taichui và H. pumilio).
- Trộn khuôn chung 3 loài CsND/HtYB/HpPT: 10 µl (50 ng/µl) CsND + 10 µl (50 ng/µl) HtYB + 10 µl (50 ng/µl) HpPT (gồm: C. sinensis, H. taichui và H. pumilio).
- Trộn khuôn chung 3 loài OvBD/HtYB/HpPT: 10 µl (500 ng/µl) OvBD + 10 µl (50 ng/µl) HtYB + 10 µl (50 ng/µl) HpPT (O. viverrini, H. taichui và H. pumilio).
Thực hiện phản ứng PCR với thành phần như trình bày ở Bảng 2.3 và chu trình nhiệt như ở Bảng 2.4; sau đó điện di trên thạch 1% để kiểm tra đánh giá sản phẩm của phản ứng (Hình 3.10A).
Hình 3.10A. Ảnh điện di kiểm tra phản ứng triplex- và quadruplex-PCR giữa 3 hoặc 4 loài C. sinensis,
O. viverrini, H. taichui và H. pumilio bố trí với 3 hay 4 căp mồi CsF-CsR (đặc hiệu C. sinensis), 489 bp; OV5F-OVN3R (đặc hiệu O. viverrini), 818 bp; HTAF-HTAR (đặc hiệu H. taichui), 250 bp; và HPUF- OV5F-OVN3R (đặc hiệu O. viverrini), 818 bp; HTAF-HTAR (đặc hiệu H. taichui), 250 bp; và HPUF- HPUR (đặc hiệu H. pumilio), 400 bp.Ghi chú: M. chỉ thị phân tử DNA 1 kb (Fermentas Inc.); Giếng 1: Hỗn hợp 4 khuôn CsND/OvBD/HtYB/HpPT (Cs+Ov+Ht+Hp); Giếng 2: Hỗn hợp 3 khuôn OvBD/HtYB/HpPT (Ov+Ht+Hp); Giếng 3: Hỗn hợp 3 khuôn CsND/HtYB/HpPT (Cs+Ht+Hp).
Kết quảđiện di sản phẩm PCR ở Hình 3.10A cho thấy:
- Giếng 1 là hỗn hợp của 4 khuôn CsND/OvBD/HtYB/HpPT (Cs+Ov+Ht+Hp)
được sử dụng 4 cặp mồi, mỗi cặp mồi cho kết quả sản phẩm PCR đặc hiệu cho mỗi loài là CsF-CsR (đặc hiệu C. sinensis), 489 bp; OV5F-OVN3R (đặc hiệu O. viverrini), 818 bp; HTAF-HTAR (đặc hiệu H. taichui), 250 bp; và HPUF-HPUR (đặc hiệu H. pumilio), 400 bp;
- Giếng 2 gồm hỗn hợp 3 khuôn OvBD/HtYB/HpPT (Ov+Ht+Hp) được sử dụng 3 cặp mồi, mỗi cặp mồi cho kết quả sản phẩm PCR đặc hiệu cho mỗi loài là CsF-CsR
M 1 2 3 818bp 818bp 400bp 489bp 250bp 250bp 500bp 750bp 1kb M 1 2 3 818bp 400bp 489bp 250bp 250bp 500bp 750bp 1kb
47
(đặc hiệu C. sinensis), 489 bp; HTAF-HTAR (đặc hiệu H. taichui), 250 bp; và HPUF- HPUR (đặc hiệu H. pumilio), 400 bp;
- Giếng 3 là hỗn hợp 3 khuôn CsND/HtYB/HpPT (Ov+Ht+Hp) được sử dụng 3 cặp mồi, mỗi cặp mồi cho kết quả sản phẩm PCR đặc hiệu cho mỗi loài là OV5F- OVN3R (đặc hiệu O. viverrini), 818 bp; HTAF-HTAR (đặc hiệu H. taichui), 250 bp; và HPUF-HPUR (đặc hiệu H. pumilio), 400 bp.
Như vậy, bộ kit quadruplex-PCR (4 cặp mồi, phát hiện 4 loài) đã được thử
nghiệm thành công. Ởđây, bộ kit AC(Cs+Ov+Ht+Hp)được sử dụng 4 cặp mồi là CsF- CsR, OV5F-OVN3R, HTAF-HTAR và HPUF-HPUR phân biệt giữa 4 loài sán lá gan nhỏ và sán lá ruột nhỏC. sinensis; O. viverrini; H. taichui và H. pumilio.
Bên cạnh đó, phản ứng triplex-PCR (3 cặp mồi, phát hiện 3 loài) cũng đã được thử nghiệm thành công. Ở đây, các bộ kit triplex-PCR, tạm kí hiệu là
CHH(Cs+Ht+Hp) được sử dụng 3 cặp mồi là CsF-CsR, HTAF-HTAR và HPUF-
HPUR phân biệt giữa 3 loài sán lá gan nhỏ và sán lá gan lớn C. sinensis; H. taichui và
H. pumilio; và bộ kit triplex-PCR, tạm kí hiệu là OHH(Ov+Ht+Hp) được sử dụng 3 cặp mồi là OV5F-OVN3R, HTAF-HTAR và HPUF-HPUR phân biệt giữa 3 loài sán lá gan nhỏ và sán lá gan lớn O. viverrini; H. taichui và H. pumilio.
Trên thực tế đối với Haplorchis spp, các loài sán lá ruột nhỏ H. pumilio và H. taichui thường tồn tại song nhiễm trong một cá thể. Sự đa nhiễm của H. pumilio và H. taichui cùng với sán lá gan nhỏ C. sinensis đã được biết đến và thường gặp ở phía Bắc Việt Nam. Tương tự, không loại trừ khả năng sự đa nhiễm giữa sán lá gan nhỏ O. viverrini với H. pumilio và H. taichui ở các tỉnh phía Nam và vùng giao nhau của O. viverrini với C. sinensis ở các tỉnh miền trung Việt Nam.