C. sinensis CsHB SLG nhỏ trưởng thành Hòa Bình (Việt Nam)
3.2.3.1.Xây dựng và thử nghiệm bộ kit số 3 (bộ kit C(Hp+Ht))
F. hepatica (multiplex-PCR) (1031bp) cox1-trnT-rrnL (16S)
3.2.3.1.Xây dựng và thử nghiệm bộ kit số 3 (bộ kit C(Hp+Ht))
Kit multiplex-PCR phân biệt hai loài sán lá ruột nhỏ H. pumilio và H. taichui
(duplex-PCR), được ký hiệu là kitC(Hp+Ht). Kit C(Hp+Ht) đượcthử nghiệm trên sán lá ruột nhỏH. pumilio (mẫu HpPT) và H. taichui (mẫu HtYB) (liệt kê ở Bảng 2.1).
Khuôn chung giữa 2 loài H. pumilio và H. taichui được hỗn hợp bằng cách pha chung theo tỉ lệ 1:1 và sử dụng các cặp mồi đặc hiệu và HPUF-HPUR (đặc hiệu H. pumilio) và HTAF-HTAR (đặc hiệu H. taichui) cho một phản ứng multiplex-PCR, tức là sử dụng 4 mồi để phát hiện 2 loài (Bảng 2.2).
Thực hiện giả nghiệm với khuôn chung HpPT/HtYB, được pha như sau: 10 µl (50 ng/µl) HpPT + 10 µl (50 ng/µl) HtYB.
Thực hiện phản ứng PCR với thành phần như trình bày ở Bảng 2.3 và chu trình nhiệt như ở Bảng 2.4; sau đó điện di trên thạch 1% để kiểm tra đánh giá sản phẩm của phản ứng (Hình 3.8A).
Kết quảở Hình 3.8A cho thấy:
- Khi sử dụng khuôn đơn của từng loài, mặc dù có cả 2 cặp mồi HPUF-HPUR và HTAF-HTAR, nhưng khi điện di trên thạch agarose 1% (nhuộm ethidium bromide), chỉ thấy xuất hiện một băng DNA có độ dài tương ứng đặc hiệu riêng với mỗi loài, đó là hoặc 250 bp của H. taichui (giếng 1) hoặc 400 bp của H. pumilio (giếng 2) (Hình 3.8A).
39
- Khi sử dụng khuôn hỗn hợp của hai loài (trộn khuôn của 2 loài), với 2 cặp mồi HPUF-HPUR và HTAF-HTAR, khi điện di trên thạch agarose 1% (nhuộm ethidium bromide), kết quả tại giếng 3 (khuôn trộn HpPT/HtYB) cho thấy, xuất hiện cùng lúc 2 băng DNA sản phẩm, một băng có kích thước 400 bp của H. pumilio và một băng có kích thước 250 bp của H. taichui, tương ứng với sản phẩm mỗi cặp mồi đặc hiệu của mỗi loài có trong phản ứng (Hình 3.8A).
Hình 3.8A. Ảnh điện di kiểm tra phản ứng duplex-PCR giữa H. pumilio và H. taichui (bộ kit C(Hp+Ht)) sử dụng 2 cặp mồi HPUF-HPUR và HTAF-HTAR. Ghi chú: M. chỉ thị phân tử DNA của thực khuẩn thể Lambda được cắt bằng enzyme HindIII; Giếng 1. mẫu HpPT (sản phẩm 400 bp); Giếng 2. mẫu /HtYB (sản phẩm 250 bp); Giếng 3. Hỗn hợp khuôn HpPT/HtYB (sản phẩm 400 bp và 250 bp). Như vậy, bộ kit duplex-PCR (multiplex-PCR 4 mồi, phát hiện hai loài) đã được thử nghiệm thành công. Ở đây, bộ kit C(Hp+Ht) được sử dụng 2 cặp mồi là HPUF- HPUR và HTAF-HTAR phân biệt giữa 2 loài sán lá ruột nhỏH. pumilio và H. taichui.
3.2.3.2.Giải trình tự kiểm tra chuỗi gen của sản phẩm
DNA sản phẩm duplex-PCR ở giếng 3 trên Hình 3.8A, được phân lập khỏi thạch agarose bằng bộ sinh phẩm AccuPrep Gel Purification Kit (Bioneer, Hàn Quốc), tinh sạch và gửi đi giải trình tự. Sử dụng mồi HPUF cho sản phẩm của H. pumilio (độ dài 400 bp) và mồi HTAF cho sản phẩm của H. taichui (độ dài 250 bp). Chuỗi nucleotide thu nhận được trình bày ở Hình 3.8B. H. pumilio TCTTGGGGTTGGTAGTGTTGACTCGGTTATGAGACTCAAGGGGGTTGGTTGATATTGTGGGTTGATAGGGATTTTATTACTTTTCGTGGGGGTTT GTGTGAGGCCTCATGCGGTTTACCTAAGCCCTTATATTGGGGTGTTGGGTGTTTTTGGGTTTGATGTAGTTAGCTTTTATCTGTGTCTGCTGTCG TTGATTCTGGGGTTGTCCATTTGATTTTGGTTTAGGAGTATGAGGGGCTTGAGGTCTTTTTTGATTTTGACGAGGATTCTAAGTTCTTTGCTGTG TTACTGTTGTTTTCATGCTGTTTGGTTTTGAATTTTCTATGAGATGTCGATAGTACCCTTGTTGGTATTATTAGTAGTAGATTCCCCCTATTCGG AGCGTTATGTTGCTTCGTGA H. taichui CGTGTGTCATAAGAGATGGTCCGCTTAATGGTTTACCAAGATTAGGGGTTAGTGTATATCCGGTTCAATATTCGTGGTTGGTGCCGCAGAGTGAG TATAGGGGGGTTATTAAAGCCAGGTCGATGTGCTGCTAATGACTTGGGGGATTATGCGTTACTGTTTAAAAGAGTCTTCTTCTAGAATGGAGGGG GGTAGTCAGGACTCGGAAGTAGGTAGGTAATGTTTAGTCTTATCGAAGGGGGATTTAGTT
Hình 3.8B. Trình tự chuỗi nucleotide của đoạn gen sản phẩm từH. pumilio (400 bp) và từH. taichui (250 bp)
được giải trình tựđể xác định sản phẩm đặc hiệu loài của phản ứng duplex PCR. Chuỗi nucleotide ngắn ở mỗi đầu là ứng với chuỗi mồi HPUF/HPUR (H. pumilio) và HTAF/HTAR (H. taichui).
M 1 2 30,5kb 0,5kb 2,0kb 2,3kb 4,3kb 400bp 250bp M 1 2 3 0,5kb 2,0kb 2,3kb 4,3kb 400bp 250bp
40