C. sinensis CsHB SLG nhỏ trưởng thành Hòa Bình (Việt Nam)
F. hepatica (multiplex-PCR) (1031bp) cox1-trnT-rrnL (16S)
3.2.7.4. Đánh giá độ nhạy của kit D(Tso+Tsa+Tas)
Kiểm tra độ nhạy của phản ứng triplex-PCR của kit D(Tso+Tsa+Tas) với độ
pha loãng cao nhất có thể thực hiện được, được thực hiện như sau: chọn khuôn DNA tổng số của mẫu TsoN1b (T. solium), TQN (T. saginata) và TaN3 (T. asiatica), được pha ở nồng độ gốc 50 ng/µl. Từ nồng độ này, DNA tổng số của các mẫu được pha loãng
58
theo cơ số 2 (2-1 đến 2-7), gấp đôi liên tục, tức là có các nồng độ sau: 20: 50ng/µl; 2-1: 25ng/µl; 2-2: 12,5ng/µl; 2-3: 6,25ng/µl; 2-4: 3,125ng/µl; 2-5: 1,5625ng/µl; 2-6: 0,78125ng/µl; 2-7: 0,390625ng/µl.
Hình 3.12D. Kiểm tra độ nhạy của triplex-PCR ở các nồng độ DNA khác nhau với khuôn hỗn hợp của
T. solium, T. saginata và T. asiatica. Ghi chú: M: Chỉ thị DNA thang 1 kb (Fermentas Inc.). Giếng: 1 = 25 ng; 2 = 12,5 ng; 3 = 6,25 ng; 4 = 3,13 ng; 5 = 1,56 ng; 6 = 0,78 ng; 7 = 0,39 ng. Đến hàm lượng 25 ng; 2 = 12,5 ng; 3 = 6,25 ng; 4 = 3,13 ng; 5 = 1,56 ng; 6 = 0,78 ng; 7 = 0,39 ng. Đến hàm lượng DNA tổng sốở 0,78 ng, băng PCR vẫn còn phát hiện được (mũi tên).
Với các độ pha loãng khác nhau như thế này, 3 µl hỗn hợp DNA của mỗi một nồng độ được sử dụng làm khuôn cho phản ứng triplex-PCR với các với mồi TSOF- TSAF-TASF-TASSR, thành phần của phản ứng và theo chu trình nhiệt như Bảng 2.3 và Bảng 2.4. Sau đó, lấy 10 µl sản phẩm của mỗi phản ứng điện di kiểm tra trên thạch agarose 1% (nhuộm Ethidium bromide).
Kết quảđiện di kiểm tra độ nhạy của phản ứng triplex-PCR ở các nồng độđược trình bày ở Hình 3.12D. Kết quả cho thấy, ở nồng độ 2-6: 0,78125ng/µl, khi sử dụng 3 µl hỗn hợp DNA của cả 3 loài làm khuôn, phản ứng PCR vẫn có thể cho phép phát hiện
được sản phẩm. Sản phẩm PCR ở các nồng độ khuôn thấp (thấp hơn khoảng 0,78 ng/phản ứng) hiển thị không được rõ lắm để cho phép đánh giá kết quả. Như vậy, kit
D(Tso+Tsa+Tas) có thể thực hiện để phát hiện được 1, 2 hay 3 loài sán dây T. solium,
T. saginata, T. asiatica ở nồng độ thấp nhất là 0,78 ng/phản ứng.