C. sinensis CsHB SLG nhỏ trưởng thành Hòa Bình (Việt Nam)
3.2.4.1.Xây dựng và thử nghiệm bộ kit số 4 (kit AB(Cs+Ov+Fh+Fg))
F. hepatica (multiplex-PCR) (1031bp) cox1-trnT-rrnL (16S)
3.2.4.1.Xây dựng và thử nghiệm bộ kit số 4 (kit AB(Cs+Ov+Fh+Fg))
Kit multiplex-PCR phân biệt 4 loài sán lá gan C. sinensis; O. viverrini; F. hepatica và F. gigantica (quadruplex-PCR), được ký hiệu là kit AB(Cs+Ov+Fh+Fg).
Kit AB(Cs+Ov+Fh+Fg) đượcthử nghiệm trên sán lá gan nhỏC. sinensis (mẫu CsND); O. viverrini (mẫu OvBD); và sán lá gan lớn F. hepatica (mẫu FhAUS) và F. gigantica
(mẫu FspT4V) (liệt kê ở Bảng 2.1).
Sử dụng 4 cặp mồi là CsF-CsR (đặc hiệu C. sinensis); OV5F-OVN3R (đặc hiệu
42
cho một phản ứng multiplex-PCR, thử nghiệm với khuôn chung của ba (triplex-PCR) hoặc bốn loài (quadruplex-PCR) giữa C. sinensis; O. viverrini; F. hepatica và F. giganticađược hỗn hợp bằng cách trộn chung theo tỉ lệ bằng nhau.
Các khuôn chung được hỗn hợp như sau:
- Trộn khuôn chung 4 loài: CsND/OvBD/FhAUS/FspT4V: 10 µl (50 ng/µl) CsND + 10 µl (50 ng/µl) OvBD + 10 µl (50 ng/µl) FhAUS + 10 µl (50 ng/µl) FspT4V (C. sinensis và O. viverrini, F. hepatica và F. gigantica).
- Trộn khuôn chung 3 loài CsND/FhAUS/FspT4V: 10 µl (50 ng/µl) CsND + 10 µl (50 ng/µl) FhAUS + 10 µl (50 ng/µl) FspT4V (gồm: C. sinensis, F. hepatica và F. gigantica).
- Trộn khuôn chung 3 loài OvBD/FhAUS/FspT4V: 10 µl (500 ng/µl) OvBD + 10 µl (50 ng/µl) FhAUS + 10 µl (50 ng/µl) FspT4V (O. viverrini, F. hepatica và F. gigantica).
Thực hiện phản ứng PCR với thành phần như trình bày ở Bảng 2.3 và chu trình nhiệt như ở Bảng 2.4; sau đó điện di trên thạch 1% để kiểm tra đánh giá sản phẩm của phản ứng (Hình 3.9A).
Hình 3.9A. Ảnh điện di kiểm tra phản ứng triplex- và quadruplex-PCR giữa 3 hoặc 4 loài C. sinensis và
O. viverrini, F. hepatica và F. gigantica bố trí với 3 hay 4 căp mồi CsF-CsR (đặc hiệu C. sinensis), 489 bp; OV5F-OVN3R (đặc hiệu O. viverrini), 818 bp; FHF-FHGR (đặc hiệu F. hepatica), 1031 bp; và bp; OV5F-OVN3R (đặc hiệu O. viverrini), 818 bp; FHF-FHGR (đặc hiệu F. hepatica), 1031 bp; và FGF-FHGR (đặc hiệu F. gigantica), 615 bp. Ghi chú: M. chỉ thị phân tử DNA 1 kb (Fermentas Inc.); Giếng 1: Hỗn hợp 4 khuôn CsND/OvBD/FhAUS/FspT4V (Cs+Ov+Fh+Fg); Giếng 2: Hỗn hợp 3 khuôn CsND/FhAUS/FspT4V (Cs+Fh+Fg); Giếng 3: Hỗn hợp 3 khuôn OvBD/FhAUS/FspT4V (Ov+Fh+Fg).
Kết quảđiện di sản phẩm PCR ở Hình 3.9A cho thấy:
- Giếng 1 là hỗn hợp của 4 khuôn CsND/OvBD/FhAUS/FspT4V (Cs+Ov+Fh+Fg) được sử dụng 4 cặp mồi, mỗi cặp mồi cho kết quả sản phẩm PCR đặc
250bp 500bp 750bp1kb 1031bp 818bp 615bp 489bp M 1 2 3 250bp 500bp 750bp1kb 1031bp 818bp 615bp 489bp M 1 2 3
43
hiệu cho mỗi loài là CsF-CsR (đặc hiệu C. sinensis), 489 bp; OV5F-OVN3R (đặc hiệu
O. viverrini), 818 bp; FHF-FHGR (đặc hiệu F. hepatica), 1031 bp; và FGF-FHGR (đặc hiệu F. gigantica), 615 bp;
- Giếng 2 gồm hỗn hợp 3 khuôn CsND/FhAUS/FspT4V (Cs+Fh+Fg) được sử
dụng 3 cặp mồi, mỗi cặp mồi cho kết quả sản phẩm PCR đặc hiệu cho mỗi loài là CsF- CsR (đặc hiệu C. sinensis), 489 bp; FHF-FHGR (đặc hiệu F. hepatica), 1031 bp; và FGF-FHGR (đặc hiệu F. gigantica), 615 bp;
- Giếng 3 là hỗn hợp 3 khuôn OvBD/FhAUS/FspT4V (Ov+Fh+Fg) được sử
dụng 3 cặp mồi, mỗi cặp mồi cho kết quả sản phẩm PCR đặc hiệu cho mỗi loài là OV5F-OVN3R (đặc hiệu O. viverrini), 818 bp; FHF-FHGR (đặc hiệu F. hepatica), 1031 bp; và FGF-FHGR (đặc hiệu F. gigantica), 615 bp.
Như vậy, bộ kit quadruplex-PCR (4 cặp mồi, phát hiện 4 loài) đã được thử
nghiệm thành công. Ở đây, bộ kit AB(Cs+Ov+Fh+Fg)được sử dụng 4 cặp mồi là CsF- CsR, OV5F-OVN3R, FHF-FHGR và FGF-FHGR phân biệt giữa 4 loài sán lá gan nhỏ
và sán lá gan lớn C. sinensis; O. viverrini; F. hepatica và F. gigantica.
Bên cạnh đó, phản ứng triplex-PCR (3 cặp mồi, phát hiện 3 loài) cũng đã được thử nghiệm thành công. Ởđây, các bộ kit triplex-PCR, tạm kí hiệu là CFF(Cs+Fh+Fg)
được sử dụng 3 cặp mồi là CsF-CsR, FHF-FHGR và FGF-FHGR phân biệt giữa 3 loài sán lá gan nhỏ và sán lá gan lớn C. sinensis; F. hepatica và F. gigantica; và bộ kit triplex-PCR, tạm kí hiệu là OFF(Ov+Fh+Fg) được sử dụng 3 cặp mồi là OV5F- OVN3R, FHF-FHGR và FGF-FHGR phân biệt giữa 3 loài sán lá gan nhỏ và sán lá gan lớn O. viverrini; F. hepatica và F. gigantica.