1.3.1. Một số enzyme thƣơng mại có trên thị trƣờng
Hiện nay các enzyme protease thƣơng mại nhƣ Alcalase, Flavourzyme, Protamex, Neutrase đƣợc ứng dụng khá phổ biến trong công nghiệp, đặc biệt trong thủy phân protein để chiết rút các chế phẩm sinh học sử dụng trong thực phẩm hoặc công nghệ sinh học (Trang Sĩ Trung, 2007, 2008, 2010; Chakrabarti, 2002; Gilmartin và Jervis, 2002; Holanda và Netto, 2006; Nchienzia và cộng sự, 2010) [14, 20, 28, 33, 42].
Đặc điểm chung của các enzyme này có khoảng pH thích hợp rộng, thƣờng từ 5,5 - 7,5; vì vậy, khi ứng dụng thủy phân thì có thể thích ứng với pH môi trƣờng tự nhiên của nguyên liệu thủy sản mà không cần điều chỉnh pH. Nhiệt độ thích hợp của các enzyme này dao động trong khoảng từ 45 – 600C. Ví dụ, điều kiện hoạt động tốt nhất của Alcalase là pH 6,5 – 8,5 ở nhiệt độ 55 – 700
C (Gilmartin và Jervis, 2002) [28].
Bảng 1.7. Điều kiện hoạt động thích hợp của một số protease thƣơng mại thông dụng [28, 44]
Enzyme pH Nhiệt độ (oC) Nguồn Phân loại
Alcalase 6,5 – 8,5 55 – 70 Bacillus licheniformis
endoprotease Protamex 5,5 – 7,5 35 – 60 Bacillus sp, endoprotease Neutrase 5,5 – 7,5 45 – 55 Bacillus subtilis endoprotease Corolase LAP 6 – 9 < 70 Bacillus subtilis exopeptidase Flavourzyme* 5,5 – 7,5 50 – 55 Aspergillus
oryzae
exopeptidase
* Flavourzyme có cả tính endopeptidase và exopeptidase tuy nhiên tính exopeptidase mạnh hơn, nên thường được xếp vào loại là exopeptidase.
Việc áp dụng enzyme trong việc thủy phân protein đã góp phần nâng cao chất lƣợng chitin, chitosan và protein. Sản phẩm protein thu đƣợc có thể sử dụng làm thức ăn gia súc hoặc thực phẩm cho ngƣời. Holanda và Netto [33] đã nghiên cứu ứng dụng enzyme Alcalase để thủy phân protein từ phế liệu tôm Xiphopenaeus kroyeri thu hồi đƣợc 65% protein (tính trên lƣợng protein có trong phế liệu tôm). Ngoài ra, quy trình ứng dụng Alcalase cho phép thu hồi lƣợng astaxanthin đáng kể. Sử dụng enzyme protease để thủy phân chitin tạo chitosan nhằm làm tăng chất lƣợng của chitosan sử dụng. Việc sử dụng protease thủy phân protein cho phép nâng cao chất lƣợng protein, chitin thu đƣợc từ phế liệu tôm, tận thu đƣợc protein và carotenoid, đây là các sản phẩm rất có giá trị, có thể sử dụng làm thức ăn cho gia súc hoặc sản xuất các chất mùi, chất dẫn dụ (Trang Sĩ Trung và cộng sự, 2007) [14]. Ngoài ra, việc tận thu bột đạm giàu carotenoid còn giúp hạn chế các chất hữu cơ chứa trong nƣớc thải của quá trình sản xuất, giảm thiểu chi phí xử lý môi trƣờng. Đây là một hƣớng đi theo phƣơng pháp sản xuất sạch hơn.
Trên thế giới, nhiều công trình nghiên cứu đã ứng dụng protease trong việc chiết xuất protein từ phế liệu tôm. Synowiecki và cộng sự [57] sử dụng enzyme Alcalase để thủy phân protein từ phế liệu tôm Crangon, protein thu đƣợc có chất lƣợng tốt có thể dụng trong chế biến thức ăn gia súc. Sử dụng protease để thay thế cho NaOH khắc phục đƣợc các hạn chế của việc sử dụng hóa chất. Tại Việt Nam, một số
nghiên cứu đã ứng dụng protease (papain, Alcalase, Flavourzyme) để khử protein trong quá trình sản xuất chitin. Các enzyme tripsin, pepsin và papain cũng đƣợc nghiên cứu để thủy phân carotenoprotein từ vỏ tôm Metapenaeus monoceros
(Chakrabarti, 2002)[20]. Kết quả cho thấy, trypsin có hiệu suất thu hồi carotenoid cao nhất là 55% trong 4 giờ ở 28oC, pepsin và papain chỉ thu đƣợc 50%.
1.3.2. Kết hợp hai enzyme protease trong quá trình thu nhận đạm giàu carotenoid
Quá trình thủy phân protein có thể đƣợc tiến hành bằng cách sử dụng đơn protease hoặc kết hợp nhiều protease. Villanueva và cộng sự cho biết khi thủy phân một enzyme protease, hiệu suất thƣờng đạt không cao do enzyme đó chỉ mang một trong hai đặc tính hoặc là exoprotease hoặc là endoprotease, ngoài ra việc kết hợp hai enzyme nâng cao đƣợc hiệu suất thủy phân nhờ hiệu ứng cộng hƣởng (synergistic) [65]. Khi đánh giá hiệu quả khử protein từ phế liệu tôm trong quá trình sản xuất chitin khi sử dụng protease cũng cho thấy nếu chỉ sử dụng một protease đơn lẻ mang tính endoprotease chủ yếu hoặc exoprotease chủ yếu thì hiệu quả thủy phân không cao và chất lƣợng của sản phẩm thủy phân còn thấp vì tính đặc hiệu của từng loại protease (Trang Sĩ Trung và cộng sự, 2007) [14].
Để nâng cao hiệu suất thủy phân cũng nhƣ chất lƣợng của sản phẩm thủy phân, nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới đã kết hợp hai enzyme protease trong quá trình chiết rút, thu hồi sản phẩm thủy phân nhằm tăng hiệu quả quá trình thủy phân và chất lƣợng của sản phẩm thủy phân. Thông thƣờng, Alcalase đƣợc kết hợp với Flavourzyme, Protamex hoặc Corolase LAP (Gilmartin và Jervis, 2002; Je và cộng sự, 2009; Nurdiyana và cộng sự, 2009; Vioque và cộng sự, 1999) [28, 34, 45, 66].
Cơ sở khoa học của việc ứng dụng enzyme kết hợp cũng rất đa dạng, một số nghiên cứu đã dựa vào bản chất của mỗi protease (endoprotease và exoprotease) để kết hợp. Protease đƣợc phân thành hai dạng là endoprotease và exoprotease. Alcalase có bản chất endoprotease thủy phân các liên kết peptide ở bên trong chuỗi polypeptid. Flavourzyme, Corolase LAP có tính exoprotease chủ yếu thì cắt các liên kết ở hai đầu tận cùng của chuỗi polypeptide, các exoprotease cắt vào đầu có nhóm carboxyl tận cùng đƣợc gọi là carboxylpeptidase, những enzyme tác dụng vào đầu có nhóm amin tận cùng gọi là aminopeptidase (Whitaker và cộng sự, 2003) [67]. Các endoprotease và exoprotease kể trên kết hợp rất có hiệu quả trong việc thủy phân protein. Có thể nói
rằng, chức năng chính của endoprotease tạo ra một lƣợng lớn các chuỗi peptid có đầu C và đầu N tự do để tạo điều kiện cho các exoprotease hoạt động (Thorkelsson và Kristinsson, 2009) [60]. Vì vậy, khi kết hợp giữa protease mang bản chất endoprotease và protease mang bản chất exoprotease thì thông thƣờng quá trình thủy phân đƣợc bố trí theo tuần tự nhƣ sau: endoprotease xử lý trƣớc tiếp theo exoprotease đƣợc bổ sung vào để tiếp tục thủy phân. Ví dụ, ngƣời ta thƣờng kết hợp Alcalase với Flavourzyme (là một protease có cả tính chất endoprotease và exoprotease, nhƣng tính chất exoprotease trội hơn, là chủ yếu) thì Alcalase thƣờng đƣợc cho vào trƣớc, sau đó mới tiến hành thủy phân bằng Flavourzyme để tăng hiệu quả của quá trình thủy phân, tăng hiệu suất quá trình chiết rút và chất lƣợng sản phẩm (Je và cộng sự, 2009; Vioque và cộng sự, 1999) [34, 66]. Lƣu ý, trƣớc khi bổ sung Flavourzyme thì Alcalase phải đƣợc bất hoạt ở nhiệt độ 85oC trong thời gian 15 phút để tránh ảnh hƣởng xấu lẫn nhau vì enzyme mang bản chất là protein (Phạm Thị Trân Châu và Trần Thị Áng, 2003; Nchienzia và cộng sự, 2010) [42]. Việc bổ sung endoprotease trong giai đoạn đầu của quá trình sẽ làm tăng số lƣợng chuỗi peptid, do đó tăng số lƣợng đầu -C và đầu -N tận cùng để các exoprotease hoạt động (Whitaker và cộng sự, 2003) [67].
Tuy nhiên, một số nghiên cứu lại dựa trên cơ sở thực nghiệm nhƣ chất lƣợng sản phẩm (màu sắc, mùi vị của sản phẩm thủy phân), độ an toàn của enzyme sử dụng, hiệu quả của quá trình thủy phân để chọn cặp enzyme thích hợp lại kết hợp hai protease có cùng bản chất endoprotease nhƣ Alcalase kết hợp với Protamex (Gilmartin và Jervis, 2002; Nurdiyana và Siti Mazlina, 2009) [28, 45].
Bên cạnh đó, việc kết hợp hai protease sẽ có khả năng thủy phân tốt hơn so với sử dụng đơn protease vì tác dụng của các protease rất phức tạp, bản chất của các mạch nhánh của acid amin ở bên cạnh các liên kết peptid có ảnh hƣởng mạnh đến hoạt động của các enzyme. Trên thực tế, các protease rất đặc hiệu và tỷ lệ những liên kết peptid trong một phân tử protein bị bẻ gãy bởi một protease là không cao. Ví dụ, trypsin chỉ thủy phân liên kết peptid giữa lysine và argininine, c ò n chymotrypsin chỉ thủy phân những liên kết peptid giữa tyrosine, phenylalanine, tryptophan. Thậm chí chymosin chỉ thủy phân liên kết peptid giữa Phe105-Met106 của kappa-casein (Whitaker và cộng sự, 2003) [67].
Trong công nghiệp, nếu trong suốt quá trình thủy phân, pH của môi trƣờng phù hợp với pH hoạt động của enzyme và không biến đổi nhiều trong quá trình thủy phân
thì không cần điều chỉnh pH, giá trị pH có thể dao động quanh một khoảng nhỏ nào đó, không điều chỉnh pH cho phép thực hiện quá trình đơn giản, thuận tiện thực hiện ở quy mô lớn (Kamnerdpetch và cộng sự, 2007) [35].
Nhƣ vậy việc kết hợp nhiều enzyme protease để thủy phân protein là hƣớng đi mới, nhiều triển vọng. Việc thủy phân protein bằng hai enzyme protease thƣờng đƣợc tiến hành theo hai giai đoạn. Thông thƣờng ngƣời ta sử dụng endoprotease ở giai đoạn đầu và sau đó bổ sung exoprotease để tiếp tục thủy phân (Vioque và cộng sự, 1999) [66]. Theo Kamnerdpetch và cộng sự [35], trong quá trình thủy phân bột khoai tây, Alcalase hoặc Flavourzyme thích hợp để thủy phân hơn Novo – pro D hoặc Corolase. Tuy nhiên, độ thủy phân đạt cao nhất chỉ là 22% (đối với mẫu sử dụng Flavourzyme). Báo cáo cũng chỉ ra rằng, việc sử dụng kết hợp endoprotease Alcalase hoặc Novo – pro D và exopeptidase Flavourzyme cho hiệu quả thủy phân tốt hơn khi sử dụng đơn enzyme. Độ thủy phân đạt cao nhất 44% khi sử dụng phối hợp 2% Alcalase và 5% Flavourzyme (w/w). Hơn nữa, hàm lƣợng amino acid trong dịch thủy phân đạt rất cao, đặc biệt là các acid amin không thay thế nhƣ histidine, phenylalanine, tryptophan và tyrosine và acid amin chứa lƣu huỳnh methionine.
Thủy phân protein từ hạt cải bằng Alcalase cho thấy rằng, nếu chỉ sử dụng Alcalase thì độ thủy phân đạt tối đa là 27%; khi tiến hành ủ Alcalase trong 60 phút rồi cho tiếp Flavourzyme vào và ủ tiếp 2 giờ thì độ DH đạt tối đa là 60% (Vioque và cộng sự, 1999) [66].
Tóm lại, hiện nay đã có nhiều nghiên cứu thu nhận các sản phẩm giá trị gia tăng từ phế liệu tôm. Tuy nhiên các đề tài này chỉ tập trung thu hồi một sản phẩm chính nhƣ chitin, chitosan, protein, chất màu, chất mùi hoặc kết hợp thu hồi chitin và ĐGC nhƣng sản phẩm chitin, chitosan đƣợc xác định ƣu tiên mà không phải là ĐGC nên sản phẩm ĐGC thu nhận từ quy trình chỉ có thể ứng dụng trong chế biến thức ăn động vật thủy sản. Ngoài ra, một số qui trình đã ứng dụng enzyme protease nhƣ papain, Alcalase trong công đoạn khử protein từ phế liệu tôm để sản xuất chitin nhằm hạn chế sử dụng hóa chất, giảm ô nhiễm môi trƣờng và nâng cao chất lƣợng chitin, chitosan. Tuy nhiên, sản phẩm protein trong các quy trình này chƣa đƣợc quan tâm thu nhận đúng mức, chƣa đƣợc định hƣớng sử dụng làm thực phẩm nên chất lƣợng còn thấp. Hơn nữa, các qui trình ứng dụng protease trong xử lý phế liệu tôm hiện nay chỉ sử dụng 1 loại protease (hoặc endoprotease hoặc exoprotease) mà chƣa kết hợp 2 loại
protease (kết hợp endoprotease với exoprotease) để nâng cao hiệu suất thủy phân cũng nhƣ chất lƣợng sản phẩm thủy phân (giàu acid amin tự do). Đồng thời, vấn đề thu nhận chế phẩm ĐGC từ phế liệu đầu tôm cũng chƣa đặt ra. Vì vậy, để có thể thu nhận đƣợc cả sản phẩm chitin, chitosan có chất lƣợng cao và sản phẩm dinh dƣỡng protein, carotenoid có chất lƣợng cao thì chúng ta cần đặt vấn đề đến việc nghiên cứu kết hợp hai enzyme protease để nâng cao hiệu quả thủy phân và chất lƣợng của chế phẩm ĐGC với hàm lƣợng carotenoid cao. Vì vậy, việc “nghiên cứu thu nhận bột ĐGC từ đầu tôm thẻ chân trắng bằng phƣơng pháp xử lý kết hợp hai enzyme protease” là vấn đề mới hiện nay.
1.4. PHƢƠNG PHÁP THU HỒI CHẾ PHẨM BỘT ĐẠM
Để thu hồi protein trong dung dịch nói chung và trong dung dịch đạm đƣợc tách chiết trong quá trình sản xuất chitin nói riêng thì quan trọng là phải có phƣơng pháp thích hợp nhất, nghĩa là hiệu suất thu hồi sản phẩm cao nhất nhƣng mức độ ảnh hƣởng đến chất lƣợng của sản phẩm thấp nhất. Một số phƣơng pháp thu hồi bột đạm thông dụng nhƣ sau:
1.4.1. Phƣơng pháp thu hồi bằng pH đẳng điện (pI)
Kết tủa protein bằng cách thay đổi pH của dung dịch là phƣơng pháp thƣờng đƣợc sử dụng để kết tủa các protein hòa tan trong dung dịch. Tại điểm pH đẳng điện (pI) điện tích của protein bằng không, tƣơng tác tĩnh điện giữa các phân tử là nhỏ nhất, đồng thời sự tƣơng tác giữa các phân tử protein với các phân tử nƣớc bị giảm, dẫn đến lớp vỏ hydrate bên ngoài bị phá vỡ, làm tăng tƣơng tác giữa các phân tử protein, tạo điều kiện cho các phân tử protein tập hợp lại với nhau hình thành kết tủa. Ở đây do không có sự thay đổi cấu trúc phân tử nên sau khi loại bỏ tác nhân gây kết tủa ra khỏi dung dịch thì các phân tử protein có thể hòa tan trở lại [12, 48].
Vì cơ chế kết tủa bằng pH có thể mang tính thuận nghịch nên áp dụng để tách hợp chất protein có hoạt tính sinh học ra khỏi hỗn hợp mà vẫn đảm bảo giữ đƣợc hoạt tính và cấu trúc phân tử tuy nhiên thời gian tủa thƣờng xảy ra rất lâu, hiệu suất thu hồi lại thấp và chi phí cao nên hiệu quả kinh tế không cao.
1.4.2. Phƣơng pháp thu hồi bằng xử lý nhiệt
Nhiệt độ cao sẽ làm phá lớp vỏ điện tích và làm giảm khả năng hydrate hóa của phân tử protein, phá vỡ liên kết giữa các phân tử protein, giữa phân tử protein với
nƣớc, do đó khả năng hấp thụ nƣớc của protein bị giảm (Trang Sĩ Trung, 2008; Guerrero và cộng sự, 1997) [12, 29]. Mỗi loại protein khác nhau đều có nhiệt độ biến tính khác nhau, cƣờng độ và thời gian quyết định mức độ biến đổi protein, trong đa số các trƣờng hợp các protein đều bắt đầu biến tính ở nhiệt độ khoảng 45 – 50oC, nhiệt độ càng tăng thì mức độ biến tính càng sâu sắc.
Protein khi đƣợc gia nhiệt ở điểm đẳng điện sẽ cho kết tủa nhanh hơn, do đó ngƣời ta thƣờng dùng cách này để phân lập và tinh chế protein từ lactoserum, máu hoặc huyết tƣơng (Pinotti và cộng sự, 1997) [48]. Kết tủa protein bằng nhiệt có rất nhiều ƣu điểm trong việc tách protein từ dung dịch mà khi chúng ta ít quan tâm đến hoạt tính hay cấu trúc của nó. Phƣơng pháp kết tủa này xảy ra nhanh hơn, triệt để, ít gây ô nhiễm môi trƣờng. Tuy nhiên, chi phí năng lƣợng cho quá trình gia nhiệt quá lớn khi thực hiện ở quy mô công nghiệp.
1.4.3. Phƣơng pháp thu hồi bằng polyme (chitosan)
Nhiều nghiên cứu cho thấy chitosan có thể sử dụng nhƣ là tác nhân thu hồi protein từ nƣớc thải của ngành công nghệ thực phẩm nhƣ thu hồi protein từ nƣớc rửa surimi, dịch thải máu cá, nƣớc thải trong quá trình chế biến cá, chế biến sữa… Cơ chế của tác nhân này tƣơng tự nhƣ các dung môi hữu cơ, các polyme sẽ làm mất lớp vỏ hydrate bao quanh phân tử protein gây nên kết tủa protein (Trang Sĩ Trung và cộng sự, 2010; Pinotti và cộng sự, 1997) [13, 48].
Trong các polyme hữu cơ thì chitosan đƣợc ứng dụng rộng rãi vì tính chất đặc trƣng mang điện tích dƣơng nên có thể tƣơng tác với phần lớn các chất hữu cơ mang điện tích âm. Chitosan thể hiện là một chất keo tụ, tạo bông tốt, ứng dụng có hiệu quả trong việc thu hồi các chất hữu cơ trong nƣớc, đặc biệt là protein. Bổ sung chitosan với vai trò là chất trợ lắng ở tỷ lệ 80 ppm có thể thu hồi đƣợc trên 55% protein hòa tan trong nƣớc rửa surimi với thời gian xử lý 15 – 20 phút (Trang Sĩ Trung và cộng sự, 2010) [13]. Phân tử chitosan cũng có khả năng hấp phụ, tạo cầu nối để liên kết các hạt keo protein đã kết tủa thành các phân tử có kích thƣớc lớn hơn và lắng xuống. Ngoài ra, chitosan có độ deacetyl cao thì trong dung dịch có chứa nhiều gốc amin tích điện dƣơng sẽ trung hòa điện tích của các phân tử protein tích điện âm trong dung dịch nƣớc rửa, giảm khả năng hydrat hóa, tập hợp lại và kết tụ (Trang Sĩ Trung và cộng sự, 2010) [13]. Ngoài ra, nồng độ chitosan cũng ảnh hƣởng lớn đến hiệu quả thu hồi, cần sử dụng chitosan ở một nồng độ hợp lý vì khi tăng nồng độ chitosan làm tăng số điện
tích cùng dấu, đẩy nhau tạo nên một mạng lƣới keo, nên cản trở quá trình keo tụ lắng xuống của các phân tử protein. Chitosan có độ deacetyl hóa càng cao thì các nhóm tích điện dƣơng trên mạch chitosan càng nhiều, thuận lợi trong tƣơng tác ion để thu hồi protein hòa tan.
Ƣu điểm của phƣơng pháp này là các kết tủa polyme hầu nhƣ không gây biến tính protein, không độc hại và hiệu quả thu nhận cao. Do đó phƣơng pháp này áp dụng