Quá trình thủy phân protein có thể đƣợc tiến hành bằng cách sử dụng đơn protease hoặc kết hợp nhiều protease. Villanueva và cộng sự cho biết khi thủy phân một enzyme protease, hiệu suất thƣờng đạt không cao do enzyme đó chỉ mang một trong hai đặc tính hoặc là exoprotease hoặc là endoprotease, ngoài ra việc kết hợp hai enzyme nâng cao đƣợc hiệu suất thủy phân nhờ hiệu ứng cộng hƣởng (synergistic) [65]. Khi đánh giá hiệu quả khử protein từ phế liệu tôm trong quá trình sản xuất chitin khi sử dụng protease cũng cho thấy nếu chỉ sử dụng một protease đơn lẻ mang tính endoprotease chủ yếu hoặc exoprotease chủ yếu thì hiệu quả thủy phân không cao và chất lƣợng của sản phẩm thủy phân còn thấp vì tính đặc hiệu của từng loại protease (Trang Sĩ Trung và cộng sự, 2007) [14].
Để nâng cao hiệu suất thủy phân cũng nhƣ chất lƣợng của sản phẩm thủy phân, nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới đã kết hợp hai enzyme protease trong quá trình chiết rút, thu hồi sản phẩm thủy phân nhằm tăng hiệu quả quá trình thủy phân và chất lƣợng của sản phẩm thủy phân. Thông thƣờng, Alcalase đƣợc kết hợp với Flavourzyme, Protamex hoặc Corolase LAP (Gilmartin và Jervis, 2002; Je và cộng sự, 2009; Nurdiyana và cộng sự, 2009; Vioque và cộng sự, 1999) [28, 34, 45, 66].
Cơ sở khoa học của việc ứng dụng enzyme kết hợp cũng rất đa dạng, một số nghiên cứu đã dựa vào bản chất của mỗi protease (endoprotease và exoprotease) để kết hợp. Protease đƣợc phân thành hai dạng là endoprotease và exoprotease. Alcalase có bản chất endoprotease thủy phân các liên kết peptide ở bên trong chuỗi polypeptid. Flavourzyme, Corolase LAP có tính exoprotease chủ yếu thì cắt các liên kết ở hai đầu tận cùng của chuỗi polypeptide, các exoprotease cắt vào đầu có nhóm carboxyl tận cùng đƣợc gọi là carboxylpeptidase, những enzyme tác dụng vào đầu có nhóm amin tận cùng gọi là aminopeptidase (Whitaker và cộng sự, 2003) [67]. Các endoprotease và exoprotease kể trên kết hợp rất có hiệu quả trong việc thủy phân protein. Có thể nói
rằng, chức năng chính của endoprotease tạo ra một lƣợng lớn các chuỗi peptid có đầu C và đầu N tự do để tạo điều kiện cho các exoprotease hoạt động (Thorkelsson và Kristinsson, 2009) [60]. Vì vậy, khi kết hợp giữa protease mang bản chất endoprotease và protease mang bản chất exoprotease thì thông thƣờng quá trình thủy phân đƣợc bố trí theo tuần tự nhƣ sau: endoprotease xử lý trƣớc tiếp theo exoprotease đƣợc bổ sung vào để tiếp tục thủy phân. Ví dụ, ngƣời ta thƣờng kết hợp Alcalase với Flavourzyme (là một protease có cả tính chất endoprotease và exoprotease, nhƣng tính chất exoprotease trội hơn, là chủ yếu) thì Alcalase thƣờng đƣợc cho vào trƣớc, sau đó mới tiến hành thủy phân bằng Flavourzyme để tăng hiệu quả của quá trình thủy phân, tăng hiệu suất quá trình chiết rút và chất lƣợng sản phẩm (Je và cộng sự, 2009; Vioque và cộng sự, 1999) [34, 66]. Lƣu ý, trƣớc khi bổ sung Flavourzyme thì Alcalase phải đƣợc bất hoạt ở nhiệt độ 85oC trong thời gian 15 phút để tránh ảnh hƣởng xấu lẫn nhau vì enzyme mang bản chất là protein (Phạm Thị Trân Châu và Trần Thị Áng, 2003; Nchienzia và cộng sự, 2010) [42]. Việc bổ sung endoprotease trong giai đoạn đầu của quá trình sẽ làm tăng số lƣợng chuỗi peptid, do đó tăng số lƣợng đầu -C và đầu -N tận cùng để các exoprotease hoạt động (Whitaker và cộng sự, 2003) [67].
Tuy nhiên, một số nghiên cứu lại dựa trên cơ sở thực nghiệm nhƣ chất lƣợng sản phẩm (màu sắc, mùi vị của sản phẩm thủy phân), độ an toàn của enzyme sử dụng, hiệu quả của quá trình thủy phân để chọn cặp enzyme thích hợp lại kết hợp hai protease có cùng bản chất endoprotease nhƣ Alcalase kết hợp với Protamex (Gilmartin và Jervis, 2002; Nurdiyana và Siti Mazlina, 2009) [28, 45].
Bên cạnh đó, việc kết hợp hai protease sẽ có khả năng thủy phân tốt hơn so với sử dụng đơn protease vì tác dụng của các protease rất phức tạp, bản chất của các mạch nhánh của acid amin ở bên cạnh các liên kết peptid có ảnh hƣởng mạnh đến hoạt động của các enzyme. Trên thực tế, các protease rất đặc hiệu và tỷ lệ những liên kết peptid trong một phân tử protein bị bẻ gãy bởi một protease là không cao. Ví dụ, trypsin chỉ thủy phân liên kết peptid giữa lysine và argininine, c ò n chymotrypsin chỉ thủy phân những liên kết peptid giữa tyrosine, phenylalanine, tryptophan. Thậm chí chymosin chỉ thủy phân liên kết peptid giữa Phe105-Met106 của kappa-casein (Whitaker và cộng sự, 2003) [67].
Trong công nghiệp, nếu trong suốt quá trình thủy phân, pH của môi trƣờng phù hợp với pH hoạt động của enzyme và không biến đổi nhiều trong quá trình thủy phân
thì không cần điều chỉnh pH, giá trị pH có thể dao động quanh một khoảng nhỏ nào đó, không điều chỉnh pH cho phép thực hiện quá trình đơn giản, thuận tiện thực hiện ở quy mô lớn (Kamnerdpetch và cộng sự, 2007) [35].
Nhƣ vậy việc kết hợp nhiều enzyme protease để thủy phân protein là hƣớng đi mới, nhiều triển vọng. Việc thủy phân protein bằng hai enzyme protease thƣờng đƣợc tiến hành theo hai giai đoạn. Thông thƣờng ngƣời ta sử dụng endoprotease ở giai đoạn đầu và sau đó bổ sung exoprotease để tiếp tục thủy phân (Vioque và cộng sự, 1999) [66]. Theo Kamnerdpetch và cộng sự [35], trong quá trình thủy phân bột khoai tây, Alcalase hoặc Flavourzyme thích hợp để thủy phân hơn Novo – pro D hoặc Corolase. Tuy nhiên, độ thủy phân đạt cao nhất chỉ là 22% (đối với mẫu sử dụng Flavourzyme). Báo cáo cũng chỉ ra rằng, việc sử dụng kết hợp endoprotease Alcalase hoặc Novo – pro D và exopeptidase Flavourzyme cho hiệu quả thủy phân tốt hơn khi sử dụng đơn enzyme. Độ thủy phân đạt cao nhất 44% khi sử dụng phối hợp 2% Alcalase và 5% Flavourzyme (w/w). Hơn nữa, hàm lƣợng amino acid trong dịch thủy phân đạt rất cao, đặc biệt là các acid amin không thay thế nhƣ histidine, phenylalanine, tryptophan và tyrosine và acid amin chứa lƣu huỳnh methionine.
Thủy phân protein từ hạt cải bằng Alcalase cho thấy rằng, nếu chỉ sử dụng Alcalase thì độ thủy phân đạt tối đa là 27%; khi tiến hành ủ Alcalase trong 60 phút rồi cho tiếp Flavourzyme vào và ủ tiếp 2 giờ thì độ DH đạt tối đa là 60% (Vioque và cộng sự, 1999) [66].
Tóm lại, hiện nay đã có nhiều nghiên cứu thu nhận các sản phẩm giá trị gia tăng từ phế liệu tôm. Tuy nhiên các đề tài này chỉ tập trung thu hồi một sản phẩm chính nhƣ chitin, chitosan, protein, chất màu, chất mùi hoặc kết hợp thu hồi chitin và ĐGC nhƣng sản phẩm chitin, chitosan đƣợc xác định ƣu tiên mà không phải là ĐGC nên sản phẩm ĐGC thu nhận từ quy trình chỉ có thể ứng dụng trong chế biến thức ăn động vật thủy sản. Ngoài ra, một số qui trình đã ứng dụng enzyme protease nhƣ papain, Alcalase trong công đoạn khử protein từ phế liệu tôm để sản xuất chitin nhằm hạn chế sử dụng hóa chất, giảm ô nhiễm môi trƣờng và nâng cao chất lƣợng chitin, chitosan. Tuy nhiên, sản phẩm protein trong các quy trình này chƣa đƣợc quan tâm thu nhận đúng mức, chƣa đƣợc định hƣớng sử dụng làm thực phẩm nên chất lƣợng còn thấp. Hơn nữa, các qui trình ứng dụng protease trong xử lý phế liệu tôm hiện nay chỉ sử dụng 1 loại protease (hoặc endoprotease hoặc exoprotease) mà chƣa kết hợp 2 loại
protease (kết hợp endoprotease với exoprotease) để nâng cao hiệu suất thủy phân cũng nhƣ chất lƣợng sản phẩm thủy phân (giàu acid amin tự do). Đồng thời, vấn đề thu nhận chế phẩm ĐGC từ phế liệu đầu tôm cũng chƣa đặt ra. Vì vậy, để có thể thu nhận đƣợc cả sản phẩm chitin, chitosan có chất lƣợng cao và sản phẩm dinh dƣỡng protein, carotenoid có chất lƣợng cao thì chúng ta cần đặt vấn đề đến việc nghiên cứu kết hợp hai enzyme protease để nâng cao hiệu quả thủy phân và chất lƣợng của chế phẩm ĐGC với hàm lƣợng carotenoid cao. Vì vậy, việc “nghiên cứu thu nhận bột ĐGC từ đầu tôm thẻ chân trắng bằng phƣơng pháp xử lý kết hợp hai enzyme protease” là vấn đề mới hiện nay.