2.1.1. Đầu tôm thẻ chân trắng
Đầu tôm thẻ chân trắng (Litopenaeus vannamei hoặc Penaeus vannamei) đƣợc thu nhận từ một số xí nghiệp Chế biến thủy sản tại Khánh Hòa.
Chất lƣợng nguyên liệu đầu tôm tƣơi, không bị biến đổi màu sắc nhƣ đen đầu hay đỏ đầu, không bẩn nhiễm rác và tạp chất hay lẫn vỏ tôm, đƣợc lƣu giữ lạnh với đá khô khi đƣa về phòng thí nghiệm. Lƣu ý, chỉ sử dụng đối tƣợng đầu tôm và không sử dụng vỏ tôm vì hàm lƣợng đạm giàu carotenoid trong vỏ rất ít.
Hình 2.1. Đầu tôm thẻ chân trắng 2.1.2. Enzyme protease
Chế phẩm enzyme protease ứng dụng đƣợc mua từ công ty Novozymes với tên thƣơng mại Alcalase và Flavourzyme (Novo Nordisk, Bagsvaerd, Denmark):
Alcalase là enzyme protease, đƣợc chiết xuất bằng kỹ thuật lên men chìm từ vi
khuẩn Bacillus licheniformis, ở dạng lỏng với hoạt tính endopeptidase chủ yếu. Alcalase thuộc nhóm serine protease subtilisin A. Alcalase 2,4 L có hoạt độ là 2,4 AU/g. Một đơn vị Anson là lƣợng enzyme cần thiết trong điều kiện thí nghiệm (35,50C; pH 7,6) để thủy phân haemoglobin trong một phút tạo thành sản phẩm hòa tan trong acid Tricloroacetic, phản ứng với thuốc thử Folin cho ta độ hấp thu OD ở bƣớc sóng 660nm tƣơng ứng với 1mM Tyrosin trong đƣờng chuẩn [65].
Flavourzyme là enzyme protease (peptidase) mang cả hai hoạt tính
endoprotease và exoprotease, trong đó tính exoprotease thì chiếm ƣu thế, nên thƣờng đƣợc xem là một exoprotease. Flavourzyme đƣợc chiết xuất từ Aspergillus oryzae
bằng kỹ thuật lên men chìm, hòa tan tốt trong nƣớc. Enzyme này hoạt động thủy phân protein trong điều kiện trung tính hoặc acid yếu. Điều kiện hoạt động tối ƣu của Flavourzyme 500 L là pH 5,0–7,0 ở nhiệt độ khoảng 55oC. Flavourzyme 500 L có hoạt tính 500 LAPU/g. Đơn vị LAPU là lƣợng enzyme cần thiết để thủy phân 1µM của L- Leucine-p-nitroanilide thành L-Leucine và p-nitroaniline ở điều kiện pH 7,2 và 37oC trong một phút [65].
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
+ Thu mẫu và xử lý mẫu: Đầu tôm thẻ chân trắng tƣơi đƣợc thu nhận ngay sau
khi chế biến, bảo quản lạnh, vận chuyển ngay về phòng thí nghiệm, loại bỏ rác bẩn, rửa sạch tạp chất và để ráo nƣớc. Để đảm bảo sự đồng nhất của nguyên liệu trong quá trình nghiên cứu, đầu tôm tƣơi đƣợc thu mỗi đợt 10 kg, sau xử lý tạp chất, cân thành những lƣợng nhỏ đảm bảo một lần lấy mẫu làm thí nghiệm, tiến hành thí nghiệm ngay hoặc trữ đông ở -20oC cho đến khi sử dụng, thời gian bảo quản tối đa là 1 tháng.
2.2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát Thuyết minh sơ đồ: Thuyết minh sơ đồ:
Nguyên liệu đầu tôm thẻ chân trắng sau khi rửa và loại bỏ tạp chất, đƣợc gia nhiệt ở nhiệt độ 98oC trong thời gian 5 phút nhằm mục đích làm biến tính một phần protein giúp cho hỗn hợp carotenoprotein dễ bị tách ra khỏi vỏ chitin đầu tôm, ức chế enzyme nội tại và tiêu diệt vi sinh vật gây hƣ hỏng trong đầu tôm (Nguyễn Lệ Hà, 2011) [4] và xay nhỏ đến kích thƣớc từ 2-3 mm giúp cho enzyme bổ sung có điều kiện tiếp xúc với cơ chất trong đầu tôm nhiều nhất.
ĐGC đƣợc tách chiết ra khỏi đầu tôm bằng phƣơng pháp thủy phân dùng kết hợp 2 enzyme protease: Alcalase và Flavourzyme. Việc chọn lựa hai Alcalase và Flavourzyme, dựa vào hiệu quả thủy phân phế liệu tôm theo kết quả nghiên cứu của Trang Sĩ Trung [12, 63]. Trong nghiên cứu này, đầu tôm đƣợc thủy phân tuần tự với Alcalase trƣớc và Flavourzyme sau để tăng hiệu quả thủy phân. Thứ tự xử lý của từng enzyme dựa theo kết quả nghiên cứu của Je và cộng sự [34] để tăng hiệu quả của quá trình thủy phân do bởi Alcalase (có bản chất endoprotease) và Flavourzyme (có cả tính
endo- và exo-protease, tuy nhiên có bản chất exoprotease là chủ yếu) đƣợc kết hợp để thủy phân đầu tôm để tách chiết ĐGC. Sau khi thủy phân bằng Alcalase, enzyme bị bất hoạt ở nhiệt độ 85oC trong thời gian 15 phút [42] trƣớc khi bổ sung Flavourzyme.
Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát
Đầu tôm
Phân riêng Phần dịch thủy phân Phần bã
Sản xuất chitin-chitosan
Đề xuất quy trình tách chiết chế phẩm ĐGC kết hợp trong quá trình sản xuất chitin từ đầu tôm
Thu hồi chế phẩm ĐGC
Sản xuất thử chế phẩm ĐGC kết hợp trong quá trình sản xuất chitin từ đầu tôm ở quy mô 10 kg nguyên liệu
Bƣớc đầu thử nghiệm ứng dụng chế phẩm ĐGC để sản xuất bột nêm tôm Xác định điều kiện thủy phân protein bằng Acalase (tỷ lệ enzyme/đầu tôm, thời gian xử lý)
Xác định điều kiện thủy phân protein bằng Flavourzyme (tỷ lệ enzyme/đầu tôm, thời gian xử lý)
Gia nhiệt, nghiền nhỏ
Đánh giá hiệu quả thu hồi
Đánh giá chất lƣợng chế phẩm ĐGC thu đƣợc
Bƣớc đầu đề xuất quy trình chế biến bột nêm tôm từ chế phẩm ĐGC Đánh giá chất lƣợng
Sau khi thủy phân tiến hành ép để tách riêng phần dịch và phần bã. Phần bã đƣợc rửa bằng nƣớc ấm, nƣớc rửa đƣợc thu hồi cùng với phần dịch. Phần bã đƣợc đƣa sang công đoạn sản xuất chitin, chitosan còn phần dịch đƣợc tiếp tục thu hồi chế phẩm ĐGC. Các yếu tố nhƣ tỷ lệ enzyme và thời gian xử lý tối ƣu của từng enzyme đƣợc xác định thông qua hiệu suất thu hồi chế phẩm ĐGC, hàm lƣợng protein và carotenoid. Quá trình thu hồi ĐGC đƣợc thực hiện bằng phƣơng pháp kết hợp giữa kết tủa protein bằng phƣơng pháp điểm đẳng điện và xử lý nhiệt, đồng thời có thể bất hoạt đƣợc enzyme Flavourzyme để kết thúc quá trình thủy phân, ngoài ra trong quá trình này có sử dụng chitosan đóng vai trò là chất tạo tủa và keo tụ để tăng hiệu quả quá trình kết tủa protein dựa theo nghiên cứu của
[12]. Cụ thể: dịch thủy phân chứa ĐGC đƣợc điều chỉnh pH về pH 4,3-4,5 bằng HCl 10% để kết tủa protein sau đó kết hợp gia nhiệt ở nhiệt độ 70oC trong thời gian 10 phút và bổ sung chitosan ở nồng độ 100 ppm.
Phần bã rắn sau thủy phân đƣợc tiếp tục nghiên cứu làm nguyên liệu chế biến chitin và chitosan.
Sau khi chọn đƣợc quy trình tách chiết chế phẩm ĐGC, tiến hành sản xuất thử bột ĐGC kết hợp trong quá trình sản xuất chitin từ đầu tôm ở qui mô 10 kg nguyên liệu đƣợc tiến hành. Chất lƣợng bột ĐGC và chitin, chitosan đƣợc đánh giá. Bột ĐGC đƣợc thử nghiệm ứng dụng trong chế biến bột nêm.
Các bố trí thí nghiệm chi tiết đƣợc trình bày ở phần sau:
2.2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tách chiết chế phẩm đạm giàu carotenoid bằng phƣơng pháp kết hợp Alcalase và Flavourzyme phƣơng pháp kết hợp Alcalase và Flavourzyme
2.2.2.1. Xác định điều kiện thủy phân thích hợp của Alcalase trong công đoạn đầu của quá trình thu nhận đạm giàu carotenoid từ đầu tôm
1. Xác định tỷ lệ Alcalase thích hợp
Mục đích thí nghiệm: Xác định tỷ lệ enzyme Alcalase/đầu tôm đƣợc sử dụng để thủy phân đầu tôm ở giai đoạn đầu, trƣớc khi kết hợp thủy phân bằng enzyme Flavourzyme.
Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ Alcalase/đầu tôm thích hợp cho công đoạn thủy phân bằng Alcalase
*Nhiệt độ được chọn dựa trên kết quả nghiên cứu của Trang Sĩ Trung [63]. **Điều kiện thủy phân bằng Flavourzyme được thực hiện ở nhiệt độ 55o
C [12], tỷ lệ enzyme: 0,2%, thời gian 2h.
Tiến hành thí nghiệm:
- Đầu tôm đƣợc rửa sạch loại bỏ rác bẩn (cát sạn, giấy vụn, rong…), cân mỗi mẫu thí nghiệm 500g vào cốc 1 lít, cho 200 ml nƣớc vào cốc, trộn đều rồi nâng nhiệt cốc lên đến 98oC trong 5 phút. Làm nguội, nghiền nhỏ mẫu đến kích thƣớc khoảng 2-3mm, cho thêm khoảng 300 ml nƣớc (đảm bảo tỷ lệ mẫu: nƣớc là 1:1) và trộn thật đều. - Tiến hành thủy phân đầu tôm để thu hồi ĐGC bằng cặp enzyme Alcalase và Flavourzyme: Để xác định tỷ lệ Alcalase thích hợp, đầu tiên mẫu đƣợc thủy phân bằng enzyme Alcalase với các nồng độ khác nhau từ 0; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4% (w/w: khối lƣợng enzyme trên khối lƣợng đầu tôm) ở nhiệt độ 55oC trong bể ổn nhiệt lắc đảo, thời gian là 2 giờ. Bất hoạt enzyme Alcalase ở nhiệt độ 85oC trong thời gian 15 phút, sau đó làm nguội đến nhiệt độ 55oC, tiếp tục thủy phân mẫu thí nghiệm bằng enzyme Flavouzyme 0,2% (w/w) ở nhiệt độ 55oC trong bể ổn nhiệt lắc đảo, 2 giờ. Sau khi kết thúc quá trình
Đầu tôm
Thủy phân protein bằng Alcalase ở nhiệt độ 55o
C*, thời gian 2hở các tỷ lệ Alcalase/đầu tôm (v/w) khác nhau
0,1% 0,2% 0,3% 0,4%
0%
Gia nhiệt và nghiền nhỏ
Đánh giá hiệu suất thu hồi chế phẩm ĐGC, hàm lƣợng protein và carotenoid
Chọn tỷ lệ Alcalase thích hợp Thủy phân bằng Flavourzyme **
thủy phân bằng Flavourzyme, tiến hành bất hoạt enzyme Flavourzyme và thu chế phẩm ĐGC bằng cách kết hợp cả ba phƣơng pháp (điều chỉnh pH 4,3 - 4,5; gia nhiệt 70oC/10 phút và bổ sung chitosan 100ppm), sau đó ly tâm tốc độ 3500 vòng/phút trong 15 phút, nhiệt độ ly tâm cài đặt 25oC. Xác định hiệu suất thu hồi ĐGC, hàm lƣợng protein và carotenoid để chọn ra tỷ lệ enzyme Alcalase thủy phân thích hợp.
Kết quả thăm dò: Chọn đƣợc tỷ lệ enzyme Alcalase/đầu tôm thích hợp trong phƣơng pháp kết hợp thủy phân hai enzyme protease của quá trình sản xuất chitin-chitosan để thu hồi lƣợng ĐGC có hiệu suất thu hồi, hàm lƣợng đạm và caroenoid cao nhất.
2. Xác định thời gian xử lý bằng Alcalase thích hợp
Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian thích hợp cho công đoạn thủy phân bằng Alcalase
Mục đích thí nghiệm: Xác định thời gian xử lý bằng enzyme Alcalase thích hợp để thủy phân đầu tôm ở giai đoạn đầu, trƣớc khi kết hợp thủy phân bằng enzyme Flavourzyme.
Đầu tôm
Thủy phân protein bằng Alcalase ở nhiệt độ 55o
C, tỷ lệ enzyme đã xác định ở thí nghiệm trên, thời gian xử lý khác nhau
2h 4h
Gia nhiệt và nghiền nhỏ
Đánh giá hiệu suất thu hồi chế phẩm ĐGC, hàm lƣợng protein và carotenoid
Chọn thời gian xử lý thích hợp Thủy phân bằng Flavourzyme
1h 3h 5h
Tiến hành thí nghiệm:
- Đầu tôm đƣợc rửa sạch loại bỏ rác bẩn (cát sạn, giấy vụn, rong…), cân mỗi mẫu thí nghiệm 500g vào cốc 1 lít, cho 200 ml nƣớc vào cốc, trộn đều rồi nâng nhiệt cốc lên đến 98oC trong 5 phút. Làm nguội, nghiền nhỏ mẫu đến kích thƣớc khoảng 2-3mm, cho thêm khoảng 300 ml nƣớc (đảm bảo tỷ lệ mẫu: nƣớc là 1:1) và trộn thật đều. - Tiến hành thủy phân đầu tôm để thu hồi ĐGC bằng cặp enzyme Acalase + Flavourzyme: Với tỷ lệ Alcalase thích hợp đƣợc chọn sau thí nghiệm 1, ủ mẫu ở nhiệt độ 55oC trong bể ổn nhiệt lắc đảo, thời gian thực hiện thí nghiệm là 1; 2; 3; 4; 5 giờ. Bất hoạt enzyme Alcalase ở nhiệt độ 85oC trong thời gian 15 phút, sau đó làm nguội đến nhiệt độ 55oC, tiếp tục thủy phân mẫu thí nghiệm bằng Flavourzyme 0,2% (w/w) trong bể ổn nhiệt lắc đảo ở 55o
C trong 2 giờ. Sau khi kết thúc quá trình thủy phân bằng Flavourzyme, tiến hành bất hoạt enzyme Flavourzyme và thu chế phẩm ĐGC kết hợp cả ba phƣơng pháp (điều chỉnh pH 4,3 - 4,5; gia nhiệt 70oC/10 phút và bổ sung chitosan 100ppm), sau đó ly tâm tốc độ 3500 vòng/phút trong 15 phút, nhiệt độ ly tâm cài đặt 25oC. Xác định hiệu suất thu hồi ĐGC, hàm lƣợng protein và carotenoid để chọn ra thời gian thủy phân thích hợp của giai đoạn thủy phân bằng Alcalase.
Kết quả thăm dò: Chọn đƣợc thời gian xử lý bằng Alcalase thích hợp trong phƣơng pháp kết hợp thủy phân hai enzyme protease của quá trình sản xuất chitin- chitosan để thu hồi lƣợng ĐGC có hiệu suất thu hồi, hàm lƣợng đạm và caroenoid cao nhất.
2.2.2.2. Xác định điều kiện thủy phân thích hợp của Flavourzyme trong công đoạn sau của quá trình thu nhận đạm giàu carotenoid từ đầu tôm (sau khi đã xử lý bằng Alcalase)
1. Xác định tỷ lệ enzyme Flavourzyme thích hợp
Mục đích thí nghiệm: Xác định tỷ lệ enzyme Flavourzyme/đầu tôm để thủy phân đầu tôm ở giai đoạn xử lý sau khi thủy phân bằng enzyme Alcalase với tỷ lệ và thời gian thích hợp đã chọn.
Tiến hành thí nghiệm:
- Đầu tôm đƣợc rửa sạch loại bỏ rác bẩn (cát sạn, giấy vụn, rong…), cân mỗi mẫu thí nghiệm 500g vào cốc 1 lít, cho 200 ml nƣớc vào cốc, trộn đều rồi nâng nhiệt cốc lên đến 98oC trong 5 phút. Làm nguội, nghiền nhỏ mẫu đến kích thƣớc khoảng 2- 3mm, cho thêm khoảng 300 ml nƣớc (đảm bảo tỷ lệ mẫu: nƣớc là 1:1) và trộn thật đều.
Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ enzyme/đầu tôm thích hợp cho công đoạn thủy phân bằng Flavourzyme
- Tiến hành thủy phân đầu tôm để thu hồi ĐGC bằng cặp enzyme Alcalase + Flavourzyme: Tiến hành thủy phân các mẫu thí nghiệm bằng Alcalase với tỷ lệ và thời gian thích hợp đƣợc chọn sau thí nghiệm 2.2.2.1 ở nhiệt độ 55oC trong bể ổn nhiệt lắc đảo. Bất hoạt enzyme Alcalase ở nhiệt độ 850C trong thời gian 15 phút, sau đó làm nguội đến nhiệt độ 55oC, tiếp tục thủy phân mẫu thí nghiệm bằng Flavourzyme với các tỷ lệ khác nhau từ 0; 0,1; 0,2; 0,3; 0,4% (w/w) trong bể ổn nhiệt lắc đảo ở 550
C trong 2 giờ. Sau khi kết thúc quá trình thủy phân bằng Flavourzyme, tiến hành bất hoạt enzyme Flavourzyme và thu chế phẩm ĐGC kết hợp cả ba phƣơng pháp (điều chỉnh pH 4,3 - 4,5; gia nhiệt 70oC/10 phút và bổ sung chitosan 100 ppm), sau đó ly tâm tốc độ 3500 vòng/phút trong 15 phút, nhiệt độ ly tâm cài đặt 25oC. Xác định hiệu suất thu hồi ĐGC, hàm lƣợng protein và carotenoid để chọn ra tỷ lệ enzyme Flavourzyme thủy phân thích hợp.
Xử lý Alcalase với chế độ thích hợp đã xác định ở thí nghiệm 2.2.2.1
Thủy phân protein bằng Flavourzyme ở nhiệt độ 55oC, thời gian 2h ở các tỷ lệ Flavourzyme/đầu tôm (w/w) khác nhau
Chọn tỷ lệ enzyme Flavourzyme thích hợp
0,1% 0,2% 0,4%
0%
Đánh giá hiệu suất thu hồi chế phẩm ĐGC, hàm lƣợng protein và carotenoid
Đầu tôm
Gia nhiệt và nghiền nhỏ )
0,3% Bất hoạt enzyme
Kết quả thăm dò: Chọn đƣợc tỷ lệ enzyme Flavourzyme/đầu tôm thích hợp trong phƣơng pháp kết hợp thủy phân hai enzyme protease của quá trình sản xuất chitin-chitosan để thu hồi lƣợng ĐGC có hiệu suất thu hồi, hàm lƣợng đạm và caroenoid cao nhất.
2. Xác định thời gian xử lý bằng Flavourzyme thích hợp
Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian thích hợp cho công đoạn thủy phân bằng Flavourzyme
Mục đích thí nghiệm: Xác định thời gian thích hợp cho công đoạn thủy phân bằng enzyme Flavourzyme sau sau khi thủy phân bằng enzyme Alcalase với tỷ lệ và thời gian thích hợp đã chọn.
Tiến hành thí nghiệm:
- Đầu tôm đƣợc rửa sạch loại bỏ rác bẩn (cát sạn, giấy vụn, rong…), cân mỗi mẫu thí nghiệm 500g vào cốc 1 lít, cho 200 ml nƣớc vào cốc, trộn đều rồi nâng nhiệt cốc lên đến 98oC trong 5 phút. Làm nguội, nghiền nhỏ mẫu đến kích thƣớc khoảng 2-3mm, cho thêm khoảng 300 ml nƣớc (đảm bảo tỷ lệ mẫu: nƣớc là 1:1) và trộn thật đều.
Xử lý Alcalase với chế độ thích hợp đã xác định ở thí nghiệm 2.2.2.1
Thủy phân protein bằng Flavourzyme ở nhiệt độ 55o
C, tỷ lệ enzyme/đầu tôm đã xác định ở thí nghiệm trên, thời gian xử lý khác nhau
Chọn thời gian xử lý thích hợp
2h 3h 4h 5h
1h
Đánh giá hiệu suất thu hồi chế phẩm ĐGC, hàm lƣợng protein và carotenoid
Đầu tôm
Gia nhiệt và nghiền nhỏ
- Tiến hành thủy phân đầu tôm để thu hồi ĐGC bằng cặp enzyme Alcalase + Flavourzyme: Tiến hành thủy phân các mẫu thí nghiệm bằng Alcalase với tỷ lệ và thời gian thích hợp đƣợc chọn sau thí nghiệm 2.2.2.1 ở nhiệt độ 55oC trong bể ổn nhiệt lắc đảo. Bất hoạt enzyme Alcalase ở nhiệt độ 85oC trong thời gian 15 phút, sau đó làm nguội đến nhiệt độ 55oC, tiếp tục ủ mẫu bằng Flavourzyme với nồng độ thích hợp đã chọn trên mục 1, thời gian thực hiện thí nghiệm là 1; 2; 3; 4; 5 giờ, trong bể ổn nhiệt lắc đảo ở 55oC. Sau khi kết thúc quá trình thủy phân bằng Flavourzyme, tiến hành bất hoạt enzyme Flavourzyme và thu chế phẩm ĐGC kết hợp cả ba phƣơng pháp (điều chỉnh pH 4,3 - 4,5; gia nhiệt 70oC/10 phút và bổ sung chitosan 100ppm), sau đó ly tâm