d/ Nồng độ oxy hoà tan.
2.2.2. Phương phỏp kiểm nghiệm, xõy dựng tiờu chuẩn cơ sở
2.2.2.1. Phương phỏp kiểm tra hàm lượng chất tồn dư 1-NAA trong
SNL sinh khối
Định lượng 1-NAA trong SNL sinh khối bằng phương phỏp HPLC, detector huỳnh quang theo hướng dẫn của EPA - Mỹ.
a. Xõy dựng đường chuẩn
Pha dung dịch chuẩn gốc 1-NAA cú nồng độ 1 mg/ml trong acetonitril, từ đú pha loóng thành cỏc nồng độ: 5; 10; 25; 50; 100 ng/ml trong acetonitril 50%. Xỏc định mối tương quan giữa diện tớch pớc và nồng độ 1-NAA.
* Điều kiện sắc ký:
- Cột trao đổi ion mạnh (SAX): Phenomenex 4,6 x 250 mm, 5 àm. - Pha động: ACN:0,025M KH2PO4 pH 5 (25:75, v:v).
- Đẳng dũng: F = 0,8 ml/min - V = 20 ul
- Nhiệt độ: 400C
33 * Chuẩn bị dung dịch thử:
Cõn chớnh xỏc khoảng 5 g mẫu cho vào bỡnh chiết hồi lưu dung tớch 100 ml. Thờm 20 ml nước deion, lắc ngấm nước 1 phỳt, thờm 5 ml NaOH 50% và 2 giọt antifoam. Rửa thành bỡnh bằng nước cất. Đun sụi hồi lưu trong 3 giờ. Để nguội, lọc lấy dịch lọc. Trỏng bỡnh và giấy lọc với 10 ml nước. Gộp dịch lọc và dịch rửa vào bỡnh nún cú nỳt mài 250 ml. Thờm 20 ml DCM, lắc trong 1 phỳt. Chuyển vào ống ly tõm và ly tõm ở tốc độ 4000 vũng/phỳt x 10 phỳt, lấy phần dịch nổi ở trờn chuyển vào bỡnh gạn 250 ml. Acid hoỏ với khoảng 5 ml HCl đặc tới pH < 2. Để nguội, chiết bằng 20 ml DCM x 2 lần, lắc trong 1 phỳt. Chờ tỏch lớp, gạn lớp dung mụi hữu cơ phớa dưới cho chảy qua 30 g Natri sulfat khan, cú ớt bụng (được rửa trước với 5 ml DCM). Rửa lại phễu natri sulfat với 5 ml DCM. Gộp dịch chiết và dịch rửa cho vào bỡnh nún cú nỳt mài, dung tớch 50 ml. Đuổi dung mụi DCM bằng dũng nitơ nhẹ ở nhiệt độ 350C, tới cặn (10 – 20 phỳt). Thờm chớnh xỏc 10 ml DCM, đậy nắp, lắc kỹ trong 1 phỳt. Lọc qua 2 g natri sulfat khan, bỏ 2 ml dịch lọc đầu, lấy dịch lọc tiếp theo.
Lấy chớnh xỏc 1 ml dịch lọc chuyển vào cột chiết pha rắn Si-2g đó hoạt hoỏ với 5 ml n-hexan. Rửa cột với 5 ml hỗn hợp 49,5% DCM 49,5% hexan và 1% acetic acid. Rửa giải với 5 mL hỗn hợp 99% DCM 1% acetic acid x 3 lần. Gộp dịch rửa giải vào bỡnh nún nỳt mài 50 ml. Đuổi dung mụi DCM bằng dũng khớ nitơ nhẹ, ở 350C. Thờm 1 ml ACN x 2 lần, tiếp tục đuổi khớ bằng nitơ tới cặn. Thờm chớnh xỏc 10 ml ACN 50% trong nước. Đậy nắp, lắc kỹ, lọc màng 0,45 trước khi phõn tớch bằng HPLC theo điều kiện sắc ký ở trờn.
Hàm lượng (ppm) 1-NAA trong SNL sinh khối khụ theo cụng thức:
Trong đú:
- ppm: Nồng độ 1-NAA và dẫn chất trong sinh khối sõm quy đổi 1-NAA. - C: Nồng độ 1-NAA trong mẫu phõn tớch tớnh từ đường chuẩn.
- n: Hệ số pha loóng (khi mẫu phõn tớch cú nồng độ quỏ đặc, nằm ngoài khoảng tuyến tớnh khảo sỏt và phải pha loóng).
- mt: Khối lượng mẫu cõn (g). - b: Độ ẩm của bột SNL sinh khối.
C x 10 x 10 x n Hàm lượng 1-NAA (ppm) =
34
b. Định lượng 1-NAA trong mẫu SNL sinh khối
Tiến hành phõn tớch lặp lại độc lập 6 lần mẫu SNL sinh khối theo phương phỏp đó khảo sỏt ở trờn, tớnh giỏ trị trung bỡnh.
2.2.2.2. Phương phỏp xỏc định thành phần hoạt chất chớnh
a. Định tớnh
* Sõm Ngọc Linh:
Sử dụng phương phỏp sắc ký lớp mỏng (DĐVN III - phụ lục 4.4). Bản mỏng silica gel G trỏng sẵn (Merck), hoạt hoỏ ở 1000C / 30 phỳt. Dung mụi triển khai: cloroform - ethyl acetat - methanol - nước (15:40:22:10).
Thuốc thử hiện màu: dung dịch vanilin 1% trong acid sulfuric đặc. Dung dịch thử: 0,5g bột sinh khối, thờm 30ml cloroform, đun sụi hồi lưu cỏch thủy trong 1 giờ, loại bỏ dịch chiết cloroform. Đuổi hết hơi cloroform ở lớp nước bằng cỏch đun núng nhẹ trờn bếp cỏch thủy, lắc kỹ lớp nước với 30ml n-butanol. Gạn lấy dịch chiết butanol, lắc với 20ml dung dịch amoniac 10%. Gạn lấy lớp butanol, cụ trờn cỏch thuỷ đến cạn. Hoà cắn trong 1ml ethanol tuyệt đối được dung dịch chấm sắc ký.
Dung dịch đối chiếu: Lấy 0,5g bột SNL, chiết như dung dịch thử.
Cỏch tiến hành: Chấm riờng biệt lờn bản mỏng 10 àl mỗi dung dịch đối chiếu và dung dịch thử thành 2 vạch (mỗi vạch dài khụng quỏ 1cm, rộng khụng quỏ 0,3cm). Sau khi triển khai được khoảng 12-14 cm, lấy bản mỏng ra, để khụ ở nhiệt độ phũng rồi phun thuốc thử hiện màu, sấy bản mỏng ở 1200C đến khi hiện rừ vết. Trờn sắc ký đồ của dung dịch thử phải cú cỏc vết cựng màu và cựng Rf với cỏc vết trờn sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu.
* Ginsenosid Rg1, ginsenosid Rd và ginsenosid Rb1
Trong phần định lượng, sắc ký đồ của dung dịch thử phải cú cỏc pớc cựng thời gian lưu với cỏc pớc ginsenosid Rg1, ginsenosid Rb1 và ginsenosid Rd trong sắc ký đồ của cỏc dung dịch ginsenosid Rg1, ginsenosid Rb1 và ginsenosid Rd chuẩn.
b. Định lượng
* Saponin toàn phần:
Saponin toàn phần trong mẫu sõm sinh khối được định lượng theo phương phỏp cõn.
35
Bột SNL sinh khối được sấy khụ tới khối lượng khụng đổi ở 500C. Cõn chớnh xỏc khoảng 1,0 g bột sinh khối sõm khụ cho vào ống ly tõm nhựa 15 ml. Thờm 10 ml methanol, chiết siờu õm (330W, 50 kHz) trong thời gian 1 giờ ở nhiệt độ 25-300C. Ly tõm mẫu ở tốc độ 2500 vũng/phỳt trong 10 phỳt. Lấy phần dịch trong phớa trờn. Cắn tiến hành chiết siờu õm lại 3 lần, như trờn. Gộp cỏc dịch chiết methanol lại bốc hơi cất quay chõn khụng ở nhiệt độ ở < 500C tới khi thu được cắn khụ. Hoà tan cắn trong 5 ml nước rồi chuyển vào cột chiết pha rắn (C18, 500 mg). Rửa lần lượt với 20 ml nước, 10 ml methanol 30%, tốc độ 20 - 25 giọt/phỳt, bỏ cỏc dịch rửa. Rửa giải với 40 ml methanol, dịch rửa giải được cất thu hồi dung mụi trong ỏp suất giảm tới cắn. Sấy tới khối lượng khụng đổi, cõn xỏc định saponin toàn phần.
Hàm lượng saponin toàn phần (%) tớnh theo chế phẩm khụ tuyệt đối: msaponin ì 100
X(%) =
mt Trong đú:
X(%): Hàm lượng saponin toàn phần (%)
mt: Khối lượng mẫu SNL sinh khối khụ tuyệt đối(g). msaponin: Khối lượng saponin toàn phần (g).
* Ginsenosid Rg1, ginsenosid Rd và ginsenosid Rb1
Định lượng ginsenosid Rb1, Rd, Rg1 bằng phương phỏp sắc ký lỏng hiệu năng cao cú so sỏnh với ginsenosid chuẩn [5].
- Xõy dựng đường chuẩn:
Pha dung dịch chuẩn gốc ginsenosid Rg1 (hoặc Rb1, Rd) trong methanol cú nồng độ 1 mg/ml. Pha loóng dung dịch chuẩn gốc thành cỏc nồng độ: 50, 100; 150; 200; 250 àg/ml. Tiến hành sắc ký để xỏc định diện tớch cỏc pớc, tỡm mối tương quan giữa diện tớch pớc và nồng độ.
- Điều kiện sắc ký:
+ Cột Apollo C18 (5àm, 25cm x 4mm ) hoặc cột tương đương + Pha động:
. Dung mụi A: Hỗn hợp Acetonitril - nước (8:2). . Dung mụi B: Nước.
36
Bảng 2.3. Chương trỡnh pha động
Thời gian (phỳt) Dung mụi A Dung mụi B
0 --> 25 22 78 25 --> 40 22 --> 35 78 --> 65 40 --> 75 35 --> 42 65 --> 58 75 --> 80 42 --> 100 58 --> 0 80 --> 85 100 --> 22 0 -->78 85 --> 95 22 78 + Tốc độ dũng: 2 ml/phỳt. + Detector UV ở bước súng 203 nm. + Thể tớch tiờm: 10 àl. - Chuẩn bị dung dịch thử:
Cõn chớnh xỏc khoảng 1 g chế phẩm vào bỡnh nún cú nỳt mài 100 ml, thờm chớnh xỏc 50 ml methanol, đậy nỳt, cõn chớnh xỏc khối lượng. Đun sụi hồi lưu cỏch thủy trong 1 giờ, để nguội, cõn xỏc định lại khối lượng, thờm methanol để bổ sung khối lượng mất đi (nếu cần). Ly tõm, hỳt chớnh xỏc 25 ml dịch ly tõm, cụ trờn cỏch thủy đến cạn. Hũa cắn trong 5ml nước, chuyển vào cột chiết xuất pha rắn (C18, 360 mg đó được hoạt hoỏ lần lượt với 5 ml MeOH, 5 ml MeOH 50%, 5 ml nước). Mở khoỏ, cho dung dịch chảy qua cột với tốc độ 20-25 giọt/phỳt. Khi dung dịch thử chảy vừa đến mặt trờn của lớp bột trong cột, đúng khoỏ. Dựng 20ml nước để trỏng rửa cốc và giấy lọc rồi chuyển vào cột chiết xuất pha rắn trờn. Tiếp tục mở khoỏ để dung dịch chảy với tốc độ ở trờn. Bỏ dung dịch nước chảy ra. Rửa tiếp với 10ml methanol 30% với tốc độ như trờn. Bỏ cỏc dịch rửa methanol. Rửa giải tiếp với 40ml methanol. Hứng lấy dịch chiết methanol, cụ trờn cỏch thuỷ đến cạn. Dựng methanol để hoà tan và chuyển toàn bộ cắn vào bỡnh định mức 10 ml, thờm methanol vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45àm.
Trong suốt quỏ trỡnh chuẩn bị dung dịch thử, khụng được để cột khụ.
- Tiến hành:
Tiến hành sắc ký theo điều kiện đó nờu, ghi thời gian lưu và diện tớch của cỏc pớc ginsenosid Rg1, Rb1 và Rd trong mỗi dung dịch. Tớnh nồng độ cỏc ginsenosid trong mẫu HPLC dựa vào đường chuẩn, từ đú tớnh hàm lượng ginsenosid trong chế phẩm.
37
Hàm lượng (g) ginsenosid Rg1 (hoặc ginsenosid Rb1 hoặc ginsenosid Rd) trong 100g chế phẩm được tớnh theo cụng thức:
C ì 50 ì 10 ì 100 X(g) =
mt(1-b) ì 25 ì 106 Trong đú:
C: Nồng độ Rg1 (hoặc Rb1 hoặc Rd àg/ml) trong dung dịch thử tớnh từ đường chuẩn.
mt: Khối lượng của mẫu thử (g).
b: Độ ẩm của chế phẩm (tớnh theo số thập phõn).
2.2.2.3. Nghiờn cứu xõy dựng tiờu chuẩn cơ sở
a. Nghiờn cứu xõy dựng tiờu chuẩn cơ sở rễ SNL tự nhiờn
* Nguồn gốc: rễ SNL tươi (Panax vietnamensis Ha et Grushv), họ
Nhõn sõm (Araliaceae).
* Mụ tả, vi phẫu, soi bột: tiến hành theo DĐVN III, chuyờn luận Sõm
Việt Nam.
* Tro toàn phần: DĐVNIII, Phụ lục 7-6.
* Định tớnh:
- Phương phỏp sắc ký lớp mỏng.
Dung dịch thử: rễ SNL tự nhiờn tươi, được nghiền thành bột, lấy 0,5 g bột chế phẩm, tiến hành tương tự mục a, 2.2.2.2 phần định tớnh SNL.
Yờu cầu: Trờn sắc ký đồ của dung dịch thử phải cú cỏc vết cựng màu và cựng Rf với cỏc vết trờn sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu.
- Phương phỏp húa học: lấy 1 g dược liệu, thờm 5 lớt methanol. Đun cỏch thủy 16 phỳt, để nguội, được dịch lọc A. Thờm 3- 5 ml nước cất, lắc đều tạo bọt cao và bền sau 15 phỳt.
- Phương phỏp HPLC để xỏc định ginsenosid Rg1, Rb1 và Rd:tương tự mục a, 2.2.2.2.
* Định lượng:
38
Saponin toàn phần trong mẫu sõm sinh khối được định lượng theo phương phỏp cõn.
SNL được nghiền nhỏ và sấy khụ tới khối lượng khụng đổi ở 500C. Cõn chớnh xỏc khoảng 0,2 g bột sinh khối sõm khụ cho vào ống ly tõm nhựa 15 ml, rồi tiến hành tương tự mục b, 2.2.2.2.
- Ginsenosid Rg1, Rb1 và Rd: Tiến hành tương tự mụcb, 2.2.2.2.
+ Dung dịch thử: Nghiền nhỏ, sấy khụ bột chế phẩm tới khối lượng khụng đổi. Cõn chớnh xỏc khoảng 0,2 g bột chế phẩm vào bỡnh nún cú nỳt mài 100 ml, rồi tiến tương tự mụcb, 2.2.2.2.
+ Dung dịch chuẩn:
Dung dịch chuẩn ginsenosid Rg1 trong methanol cú nồng độ đó biết khoảng 0,2mg trong 1ml.
Dung dịch chuẩn ginsenosid Rb1 trong methanol cú nồng độ đó biết khoảng 0,2mg trong 1ml.
Dung dịch chuẩn ginsenosid Rd trong methanol cú nồng độ đó biết khoảng 0,2mg trong 1ml.
+ Hàm lượng (g) ginsenosid Rg1 (hoặc ginsenosid Rb1 hoặc ginsenosid Rd) trong 100g chế phẩm khụ tuyệt đối được tớnh theo cụng thức:
At ì Cc ì 50 ì 10 ì 100 X(g) =
Ac ì mtì 25 ì 1000 Trong đú:
At và Ac: Diện tớch pớc ginsenosid Rg1 (hoặc Rb1 hoặc Rd) trong dung dịch thử và dung dịch chuẩn.
Cc: Nồng độ dung dịch Rg1 (hoặc Rb1 hoặc Rd) chuẩn (mg/ml). mt: Khối lượng của mẫu thử (g).
b. Nghiờn cứu xõy dựng tiờu chuẩn cơ sở SNL sinh khối
Nguồn gốc: Là khối tế bào SNL được tạo ra bằng cụng nghệ SKTB thực vật từ nguồn rễ SNL tự nhiờn (Panax vietnamensis Ha et Grushv) trờn hệ thống Bioreactor, lọc, rửa, sấy khụ.
39
SNL sinh khối được phõn tớch đỏnh giỏ chất lượng chế phẩm theo cỏc chỉ tiờu sau đõy:
* Hỡnh thức: Kiểm tra bằng cảm quan.
* Độ ẩm: Theo quy định của DĐVN III, PL - 5.16. * Tro toàn phần: Theo quy định của DĐVN III, PL - 7.6.
* Tro khụng tan trong acid: Theo quy định của DĐVN III, PL - 7.5. * Định tớnh: Thử theo phương phỏp nờu trong mục a, 2.2.2.2
* Định lượng ginsenosid Rb1, Rd, Rg1 bằng phương phỏp sắc ký lỏng hiệu năng cao cú so sỏnh với ginsenosid chuẩn theo phương phỏp đó nờu ở mục b, 2.2.2.2. Khụng sử dụng đường chuẩn, sử dụng phương phỏp chuẩn điểm và dung dịch chuẩn được chuẩn bị như sau:
- Dung dịch chuẩn ginsenosid Rg1 trong methanol cú nồng độ đó biết khoảng 0,2mg trong 1ml.
- Dung dịch chuẩn ginsenosid Rb1 trong methanol cú nồng độ đó biết khoảng 0,2mg trong 1ml.
- Dung dịch chuẩn ginsenosid Rd trong methanol cú nồng độ đó biết khoảng 0,2mg trong 1ml.
Hàm lượng (g) Ginsenosid Rg1 (hoặc Ginsenosid Rb1 hoặc Ginsenosid Rd) trong 100g chế phẩm được tớnh theo cụng thức:
At ì Cc ì 50 ì 10 ì 100 X(g) =
Ac ì mt(1-b) ì 25 ì 1000 Trong đú:
At và Ac: Diện tớch pớc ginsenosid Rg1 (hoặc Rb1 hoặc Rd) trong dung dịch thử và dung dịch chuẩn.
Cc: Nồng độ dung dịch Rg1 (hoặc Rb1 hoặc Rd) chuẩn (mg/ml). mt: Khối lượng của mẫu thử (g).
b: Độ ẩm của chế phẩm (tớnh theo số thập phõn).
c. Xõy dựng tiờu chuẩn cơ sở cao đặc SNL sinh khối (5:1).
Cao SNL sinh khối là dạng bỏn thành phẩm, được điều chế từ SNL sinh khối (Panax vietnamesis Ha et Grushv, họ Nhõn sõm Araliace), theo phương phỏp thớch hợp để cú hoạt chất ổn định.
40
* Hỡnh thức cảm quan: thử bằng cảm quan.
* Độẩm: Thử theo DĐVN III, phụ lục 9.6.
* Tro toàn phần: Thử theo DĐVN III, phụ lục 7.6.
* Cắn khụng tan: Hoà tan 1,0 g cao trong 50 ml nước cất, lọc. Rửa cắn
bằng nước cất cho đến khi nước rửa khụng màu. Sấy cắn ở 100 = 1050C đến khối lượng khụng đổi. Tớnh hàm lượng cắn khụng tan trong chế phẩm theo cụng thức:
X = a x 100 Trong đú: a là khối lượng cắn thu được (g).
*Định tớnh:
- Sõm Ngọc Linh:
Sử dụng phương phỏp sắc ký lớp mỏng tương tự mục 2.2.8.1.
Dung dịch thử: 0,1g cao, thờm 20 ml nước, đun núng cho tan hết, để nguội, chuyển vào bỡnh gạn.
Yờu cầu: Trờn sắc ký đồ của dung dịch thử phải cú cỏc vết cựng màu và cựng Rf với cỏc vết trờn sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu.
- Ginsenosid Rg1, Rb1 và Rd: tương tựmục a, 2.2.2.2.
* Định lượng:
Ginsenosid Rg1, Rb1 và Rd: theo phương phỏp HPLC như đó nờu ở mục b, 2.2.2.2, phương phỏp chuẩn điểm.
- Mẫu thử: 0,2 g chế phẩm. - Dung dịch chuẩn:
Dung dịch chuẩn ginsenosid Rg1 trong methanol cú nồng độ đó biết khoảng 0,15 mg trong 1ml.
Dung dịch chuẩn ginsenosid Rb1 trong methanol cú nồng độ đó biết khoảng 0,25 mg trong 1ml.
Dung dịch chuẩn ginsenosid Rd trong methanol cú nồng độ đó biết khoảng 0,1mg trong 1ml.
41
Tiến hành sắc ký theo điều kiện đó nờu, ghi thời gian lưu và diện tớch của cỏc pớc ginsenosid Rg1, Rb1 và Rd trong mỗi dung dịch.
Hàm lượng (g) ginsenosid Rg1 (hoặc ginsenosid Rb1 hoặc ginsenosid Rd) trong 100g chế phẩm được tớnh theo cụng thức:
At ì Cc ì 50 ì 10 ì 100 X(mg) =
Ac ì mt(1-b) ì 25 ì 1000 Trong đú:
At và Ac: Diện tớch pớc ginsenosid Rg1 (hoặc Rb1 hoặc Rd) trong dung dịch thử và dung dịch chuẩn.
Cc: Nồng độ dung dịch Rg1 (hoặc Rb1 hoặc Rd) chuẩn (mg/ml). mt: Khối lượng của mẫu thử (g).
b: Độ ẩm của chế phẩm (tớnh theo số thập phõn).
* Độ nhiễm khuẩn:
Cõn chớnh xỏc khoảng 5,0 g chế phẩm vào bỡnh nún nỳt mài 200 ml đó được tiệt trựng và đó biết khối lượng. Thờm một lượng vừa đủ dung dịch natri clorid 0,9% vụ trựng để thu được dung dịch cú nồng độ 10-1, lắc đều. Từ dung dịch trờn, pha loóng thành cỏc nồng độ 10-2,10-3 và tiếp tục tiến hành thử theo quy định của DĐVN III về giới hạn vi khuẩn, Phụ lục 10.7.