d/ Nồng độ oxy hoà tan.
2.2.1. Phương phỏp tạo sinh khối tế bào rễ sõm Ngọc Linh
2.2.1.1. Nuụi cấy tạo callus
a. Phương phỏp tạo callus
Tiến hành theo phương phỏp của Kee-Won Yu [54] gồm cỏc bước sau: - Pha chế mụi trường thạch mềm: sử dụng cỏc mụi trường khỏc nhau: MS, White, B5, SH theo cụng thức của Kee-Won Yu [51], điều chỉnh pH = 5,8. Đổ vào mỗi ống nghiệm 5ml mụi trường, hấp thiệt khuẩn ở 1210C trong 25 phỳt. Để nguội.
- Sỏt trựng mẫu cấy: rễ sõm sau khi thu hỏi được cắt bỏ cỏc rễ nhỏ, rửa sạch bựn đất bằng nước, ngõm trong nước xà phũng loóng 15 phỳt, trỏng sạch nước xà phũng bằng nước thường, sau đú trỏng lại 3 lần bằng nước cất. Tiệt khuẩn với dung dịch HgCl2 0,07% trong thời gian 20 phỳt. Sau đú trỏng lại 5 lần bằng nước cất vụ khuẩn.
25
- Tỏch cỏc mụ ra khỏi rễ sõm tự nhiờn: cắt mẫu đó tiệt khuẩn thành những khoanh nhỏ cú kớch thước 2mm x 2mm x 1mm (loại bỏ phần vỏ và cỏc mụ bị ngộ độc chất sỏt khuẩn).
- Nuụi cấy trong mụi trường thạch trong điều kiện vụ khuẩn, khụng cú ỏnh sỏng, nhiệt độ 250C và độ ẩm 50% để cho cỏc tế bào phỏt triển thành callus.
Đỏnh giỏ: khả năng tạo thành callus trờn cỏc mụi trường khỏc nhau dựa trờn cỏc chỉ tiờu sau:
+ Hỡnh thỏi của callus: tế bào phỏt triển đều, sỏng màu và khụng bị nhiễm nấm mốc.
+ Khối lượng callus: khối lượng tươi và khụ.
b.Khảo sỏt ảnh hưởng của mụi trường nuụi cấy đến khả năng tạo callus
Sử dụng 4 loại mụi trường khỏc nhau cho nuụi cấy tạo callus là: MS, White, B5 và Nitsch. Phương phỏp tạo callus được mụ tả trong mục a, 2.2.1.1. Trong đú, cỏc mụi trường được bổ sung 30 gam saccarose; 1mg/l NAA và 0,1mg/l kinetin. Sau thời gian nuụi cấy, cõn khối lượng tươi và khụ. Từ đú lựa chọn mụi trường nuụi cấy thớch hợp cho callus phỏt triển.
c. Khảo sỏt ảnh hưởng của thời gian
Callus được nuụi cấy trờn mụi trường tốt nhất. Theo dừi tốc độ phỏt triển của tế bào từ ngày nuụi cấy thứ 1 đến ngày nuụi cấy thứ 45 bằng cỏch cõn xỏc định khối lượng của tế bào khụ và tươi. Từ đú xỏc định được thời gian thớch hợp cho 1 chu kỳ nuụi cấy đối với callus SNL.
d. Khảo sỏt ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng
Sử dụng 3 loại chất điều tiết sinh trưởng khỏc nhau cho nuụi cấy tạo callus là: NAA, 2,4-D và IAA cú sử dụng kết hợp với kinetin. Thời gian nuụi cấy là 35 ngày. Đỏnh giỏ sự thớch hợp của chất điều tiết sinh trưởng với callus thụng qua khối lượng tế bào khụ và tươi.
2.2.1.2. Duy trỡ nuụi cấy callus trờn mụi trường thạch
a. Phương phỏp duy trỡ nuụi cấy callus
Callus sau khi tạo được trong mụi trường nuụi cấy thớch hợp, tiến hành cấy chuyển trờn mụi trường thạch nhằm mục đớch cho tế bào phỏt triển nhanh, thớch nghi với mụi trường, đồng thời hạn chế quỏ trỡnh biệt húa của tế bào thành cỏc mụ, cỏc tổ chức. Cỏc bước tiến hành bao gồm:
26
- Pha chế và tiệt khuẩn mụi trường thạch mềm MS cú bổ sung cỏc chất điều tiết sinh trưởng khỏc nhau. Đổ vào cỏc bỡnh nún dung tớch 250ml mỗi bỡnh khoảng 75ml mụi trường, tiệt khuẩn ở 1210C trong 25 phỳt. Để nguội.
- Cấy vào mỗi bỡnh nún đó chứa sẵn mụi trường khoảng 10 gam tế bào. - Nuụi cấy tế bào trong điều kiện vụ khuẩn, khụng cú ỏnh sỏng, ở nhiệt độ 250C. Sau từng khoảng thời gian nhất định lấy mẫu kiểm tra.
- Cỏc chỉ tiờu đỏnh giỏ: + Hỡnh thỏi tế bào
+ Khối lượng tế bào khụ + Khối lượng tế bào tươi + Tỷ lệ tăng trưởng =
21 1
m m
m1: khối lượng tế bào khụ thu hoạch (gam)
m2: khối lượng tế bào khụ nuụi cấy ban đầu (gam).
b.Khảo sỏt ảnh hưởng của nồng độ chất điều tiết sinh trưởng
Từ mụi trường thớch hợp đó chọn, khảo sỏt ảnh hưởng của cỏc chất điều tiết sinh trưởng tới quỏ trỡnh sinh trưởng của callus. Sử dụng cỏc chất NAA với nồng độ thay đổi từ 0,5mg/l đến 2,5mg/l. Nuụi cấy trong điều kiện khụng cú ỏnh sỏng ở 240C trong thời gian 35 ngày. Cõn xỏc định khối lượng tế bào tươi và khụ. Từ đú lựa chọn được khoảng nồng độ NAA thớch hợp cho callus phỏt triển.
c. Khảo sỏt ảnh hưởng của pH mụi trường
Sau khi chọn được loại và nồng độ chất điều tiết sinh trưởng phự hợp nhất, tiến hành khảo sỏt ảnh hưởng của pH mụi trường tới tốc độ sinh trưởng của callus. Thay đổi pH trong cỏc khoảng khỏc nhau từ 5,2 - 6,6 và theo dừi kết quả, chọn ra pH thớch hợp.
d. Khảo sỏt ảnh hưởng của nhiệt độ
Từ mụi trường nuụi cấy đó lựa chọn được chất, nồng độ chất điều tiết sinh trưởng và pH thớch hợp nhất, tiến hành khảo sỏt ảnh hưởng của nhiệt độ đối với sự sinh trưởng của callus. Thay đổi nhiệt độ trong cỏc khoảng khỏc nhau từ 22-28°C, theo dừi kết quả và lựa chọn khoảng nhiệt độ phự hợp.
27
2.2.1.3. Nuụi cấy trong mụi trường lỏng
Khối tế bào sau khi đó mềm mại khi nuụi cấy trờn mụi trường thạch, cấy chuyển tế bào sang mụi trường lỏng trờn hệ thống mỏy lắc. Lựa chọn mụi trường MS cú bổ sung 1,5 mg/l NAA và 0,1 mg/l kinetin, 30g/l đường saccarose. Nuụi cấy trong bỡnh nún 150ml. Điều kiện nuụi cấy là: nhiệt độ 250C, độ ẩm 50%, tốc độ lắc 150 vũng/phỳt, trong điều kiện khụng cú ỏnh sỏng [61]. Cỏc bước tiến hành nuụi cấy gồm:
- Pha chế mụi trường MS theo cụng thức [18] từ cỏc dung dịch mẹ, sau đú bổ sung chất điều tiết sinh trưởng: NAA 1,5mg/l; kinetin 0,1mg/l; saccarose 30g/l. Điều chỉnh để dung dịch cú pH = 5,8. Đổ 50ml mụi trường vào mỗi bỡnh nún dung tớch 150 ml. Hấp tiệt khuẩn ở 1210C trong 25 phỳt, để nguội.
- Cấy vào mỗi bỡnh mụi trường khoảng 5 gam tế bào sõm - Nuụi cấy ở điều kiện quy định trong thời gian 25 ngày.
- Thu hoạch SKTB: sau khi kết thỳc nuụi cấy, lọc lấy tế bào, rửa sạch nhiều lần với nước để loại bỏ hết mụi trường, cõn khối lượng tế bào tươi. Sấy tế bào ở 450C đến khối lượng khụng đổi, cõn khối lượng tế bào khụ, tớnh số gam tế bào trong 1 lớt mụi trường.
a. Khảo sỏt ảnh hưởng của thời gian nuụi cấy
Chuẩn bị mụi trường lỏng MS theo phương phỏp mụ tả mục 2.2.1.3. Đỏnh giỏ tốc độ phỏt triển của tế bào theo thời gian cỏc chỉ tiờu:
+ Khối lượng tế bào tươi + Khối lượng tế bào khụ.
Sau ngày nuụi cấy thứ 2; 4; 6; 8; 10; 12; 14; 16; 18, thu hoạch tế bào, cõn xỏc định khối lượng.
b. Khảo sỏt ảnh hưởng của pH mụi trường
Nuụi cấy tế bào trong mụi trường lỏng với cỏc điều kiện như mụ tả mục 2.2.1.3. Tuy nhiờn thay đổi pH mụi trường nuụi cấy trong khoảng từ 5,2 – 5,8. Sau thời gian nuụi cấy, thu hoạch tế bào. Cõn xỏc định khối lượng tế bào tươi và khụ từ đú lựa chọn được pH mụi trường nuụi cấy thớch hợp
c. Khảo sỏt ảnh hưởng của nhiệt độ
Nuụi cấy tế bào trong mụi trường lỏng với cỏc điều kiện như mụ tả mục 2.2.1.3. Thay đổi nhiệt độ trong cỏc khoảng khỏc nhau từ 22-28°C. Theo dừi kết quả và lựa chọn nhiệt độ thớch hợp.
28
d. Lựa chọn chất điều tiết sinh trưởng cho nuụi cấy tế bào
Nuụi cấy trờn mụi trường lỏng với cỏc điều kiện như mụ tả trong mục 2.2.1.3. Sử dụng cỏc chất điều tiết sinh trưởng khỏc nhau thuộc 2 nhúm auxin và cytokinin gồm: 2,4- diclorophenoxy acetic acid (2,4-D); Indol butyric acid (IBA) và NAA nồng độ ban đầu 2mg/l, dựng riờng lẻ hay kết hợp với Kinetin nồng độ 0,2mg/l. sau thời gian nuụi cấy, cõn xỏc định khối lượng tế bào. Từ đú lựa chọn được chất điều tiết sinh trưởng phự hợp.
2.2.1.4. Tối ưu húa mụi trường.
Sau khi đó lựa chọn được cỏc chất điều tiết sinh trưởng là NAA và kinetin chỳng tụi tiến hành tối ưu húa nồng độ 2 chất này và nồng độ đường saccarose sử dụng, nhằm đỏnh giỏ ảnh hưởng của chỳng tới tốc độ phỏt triển tế bào cũng như hàm lượng saponin trong tế bào. Sử dụng phần mềm thụng minh Modde 5.0 để thiết kế thớ nghiệm nghiờn cứu và phần mềm Inform 3.1 để phõn tớch ảnh hưởng của cỏc yờu tố cũng như tối ưu húa cỏc điều kiện của thớ nghiệm [8]. Cỏc bước thực hiện tối ưu húa bao gồm:
Bước 1: Xỏc định biến đầu vào và biến đầu ra.
Biến đầu vào: Biến đầu vào là thành phần mụi trường nuụi cấy (cỏc
biến phụ thuộc) ảnh hưởng đến tốc độ phỏt triển của tế bào cũng như hàm lượng hoạt chất. Trong thiết kế nghiờn cứu này chỳng tụi xỏc định cỏc biến phụ thuộc là:
- Nồng độ NAA (X1). - Nồng độ kinetin (X2). - Nồng độ đường (X3).
Biến đầu ra: Biến đầu ra (biến độc lập) là yếu tố phản ỏnh tốc độ phỏt
triển cũng như chất lượng của khối tế bào nuụi cấy. Trong nghiờn cứu này chỳng tụi xỏc định biến đầu ra gồm cỏc yếu tố sau:
- Khối lượng tế bào khụ sau khi nuụi cấy (Y1) g/l. - Khối lượng saponin toàn phần trong tế bào(Y2) mg/g.
Bước 2: Lựa chọn cỏc giỏ trị của biến đầu vào.
Từ cỏc kết quả khảo sỏt trước đú, tham khảo cỏc tài liệu, chỳng tụi lựa chọn vựng giỏ trị của cỏc biến đầu vào (xem bảng 1). Sử dụng phương phỏp thiết kế mặt hợp tử tại tõm với sự trợ giỳp của phần mềm thiết kế thớ nghiệm tối ưu Modde 5.0 để đưa ra thiết kế thớ nghiệm nghiờn cứu.
29
Bước 3: Tiến hành thớ nghiệm
Thực hiện cỏc thớ nghiệm theo thiết kế của mụ hỡnh tối ưu mà phần mềm đưa ra, mỗi thớ nghiệm được lặp lại 6 lần lấy giỏ trị trung bỡnh.
Bảng 2.1. Ký hiệu và mức của biến đầu vào
Biến đầu vào Kớ hiệu Mức dưới Mức cơ sở Mức trờn
Nồng độ NAA (mg/l) X1 1 5,5 10
Nồng độ kinetin (mg/l) X2 0,1 0,55 1
Nồng độ đường (g/l) X3 20 37,5 55
Trong đú: X1 là nồng độ NAA; X2 là nồng độ kinetin; X3 là nồng độ đường.
Bước 4: Xỏc định giỏ trị của biến đầu ra của thực nghiệm.
Xỏc định cỏc giỏ trị biến đầu ra của cỏc thớ nghiệm theo thiết kế gồm: - Khối lượng tế bào khụ (Y1): Đỏnh giỏ tốc độ phỏt triển của tế bào. - Khối lượng saponin toàn phần(Y2): Đỏnh giỏ hàm lượng hoạt chất (chất lượng của tế bào).
Bước 5. Phõn tớch ảnh hưởng của cỏc biến đầu ra.
Sau khi cú số liệu thực nghiệm của biến đầu ra. Sử dụng phần mềm INForm 3.1 phõn tớch, đỏnh giỏ ảnh hưởng của cỏc biến đầu vào với cỏc biến đầu ra.
Bước 6: Lựa chọn điều kiện tối ưu.
Để lựa chọn được cỏc giỏ trị tối ưu của cỏc biến đầu vào thỡ cần phải đưa ra được mức độ yờu cầu của biến đầu ra. Mục đớch của nghiờn cứu này là: lựa chọn được nồng độ cỏc chất tối ưu để tế bào phỏt triển tốt nhất và hàm lượng hoạt chất cao nhất. Vỡ vậy, yờu cầu cỏc biến đầu ra cao nhất (bảng 2). Trong đú, khối lượng saponin toàn phần (Y2) là biến cú vai trũ quan trọng hơn. Do đú, trong quỏ trỡnh luyện phần mềm tối ưu, chỳng tụi tăng mức trọng số cho biến này gấp 10 lần so với biến về khối lượng tế bào (Y1).
Sử dụng phần mềm tối ưu INForm 3.1 để tối ưu húa cỏc biến đầu vào, từ đú đưa ra giỏ trị tối ưu của cỏc biến đầu vào cũng như kết quả dự đoỏn của cỏc biến đầu ra.
30
Bảng 2.2. Ký hiệu và mức yờu cầu của biến đầu ra
Biến đầu ra Kớ hiệu Mức yờu cầu
Khối lượng tế bào khụ Y1 Mức tối đa
Khối lượng saponin toàn phần Y2 Mức tối đa
Bước 7: Kiểm chứng cỏc điều kiện tối ưu.
Sau khi phần mềm đó lựa chọn được cỏc điều kiện tối ưu. Chỳng tụi tiến hành làm lại cỏc thớ nghiệm nuụi cấy. Xỏc định khối lượng tế bào khụ, khối lượng saponin toàn phần để kiểm chứng. Kết quả so sỏnh với dự đoỏn ban đầu của phần mềm.
2.2.1.5. Phương phỏp khảo sỏt cỏc chất kớch thớch làm tăng hoạt chất
Nuụi cấy trờn mụi trường lỏng đó tối ưu với cỏc điều kiện như mụ tả trong mục 2.2.1.3. Sử dụng cỏc chất kớch thớch làm tăng hoạt chất khỏc nhau và ở nồng độ khỏc nhau Sau thời gian nuụi cấy, lọc thu tế bào. Cõn xỏc định khối lượng khụ và định lượng cỏc ginsenosid trong sinh khối như mục 2.2.2.2. Từ đú, lựa chọn được chất kớch thớch hoạt chất tốt nhất.
a. Lựa chọn chất kớch thớch
Sử dụng chất kich thớch tăng hoạt chất khỏc nhau là acid jasmonic, acid ferullic, acid caffeic, metyl jasmonat và dịch chiết nấm men. Cho chất này vào ngày thứ 12 của chu kỳ nuụi cấy. Sau đú lọc, thu lấy tế bào và định lượng hoạt chất trong tế bào. Từ đú, lựa chọn chất kớch thớch tốt nhất.
b. Lựa chọn nồng độ chất kớch thớch
Sau 12 ngày nuụi cấy, cho tế bào SNL tiếp xỳc với acid jasmonic ở cỏc nồng độ: 50, 100, 150, 200, 250 và 300 àM. Tiến hành nuụi cấy thờm 2 ngày. Sau đú, định lượng hoạt chất trong tế bào. Từ đú, lựa chọn nồng độ acid jasmonic thớch hợp.
c. Lựa chọn thời điểm cho elicitor
Nuụi tế bào SNL trong mụi trường MS như mụ tả trong mục 2.2.1.3. Bổ xung acid jasmonic nồng độ 100àM/l vào mụi trường nuụi cấy vào ngày thứ 1, 3, 5, 7, 9, 11, 12, 13 và 14. Sau 2 ngày cho acid jasmonic, lọc tế bào, định lượng ginsenosid trong tế bào, từ đú lựa chọn được thời điểm bổ xung elicitor.
31
d. Lựa chọn thời gian cho tế bào tiếp xỳc với elicitor
Nuụi tế bào SNL trong mụi trường MS như mụ tả trong mục 2.2.1.3 Sau 12 ngày nuụi cấy, cho tế bào tiếp xỳc với acid jasmonic nồng độ 100àM/l ở thời điểm sau 12, 24, 36, 48, 60 và 72 giờ. Lọc tế bào, định lượng ginsenosid trong tế bào, từ đú lựa chọn được khoảng thời gian thớch hợp.
2.2.1.6. Nuụi cấy trờn hệ thống bioreactor
a. Nuụi cấy trờn hệ thống bioreactor 5 lớt
Cấy chuyển cỏc tế bào từ shaker sang hệ thống Bioreactor 5lớt trong mụi trường đó được tối ưu húa với cỏc điều kiện: nhiệt độ: 25°C; tốc độ lắc: 150 vũng/ phỳt; pH mụi trường: 5,8; thời gian nuụi cấy: 14 ngày, phõn ỏp oxy: 30%. Tỷ lệ cấy giống là 10%. Sau thời gian nuụi cấy, lọc lấy tế bào. Xỏc định tỷ lệ tăng trưởng và hàm lượng saponin toàn phần.
b. Nuụi cấy trờn hệ thống bioreactor 15 lớt
Cấy chuyển cỏc tế bào từ hệ thống Bioreactor 5 lớt sang hệ thống Bioreactor 15 lớt trong mụi trường đó được tối ưu húa với cỏc điều kiện: nhiệt độ: 25°C; tốc độ lắc: 150 vũng/ phỳt; pH mụi trường: 5,8; thời gian nuụi cấy: 14 ngày; phõn ỏp oxy: 35%. Tỷ lệ cấy giống: 10%. Sau thời gian nuụi cấy, lọc lấy tế bào, xỏc định tỷ lệ tăng trưởng và hàm lượng saponin toàn phần.
2.2.1.7. Xõy dựng quy trỡnh thu hoạch SNL sinh khối
a. Khảo sỏt biện phỏp loại bỏ 1-NAA.
NAA là chất điều tiết sinh trưởng dựng trong nuụi cấy tế bào thực vật, khi thu hoạch sinh khối cần phải loại bỏ chỳng ra khỏi sản phẩm. Tồn dư 1- NAA là vấn đề đỏng quan tõm, vỡ vậy chỳng tụi khảo sỏt cỏc quy trỡnh thu hoạch SNL sinh khối nhằm loại bỏ tối đa chất tồn dư 1-NAA nhưng khụng làm mất hoạt chất. Do đú, chỳng tụi sử dụng 2 biện phỏp loại bỏ 1-NAA và đỏnh giỏ hiệu quả của phương phỏp dựa trờn 2 chỉ tiờu là hàm lượng hoạt chất và 1-NAA tồn dư trong SNL sinh khối như sau.
- Biện phỏp 1: Mụi trường nuụi cấy tế bào cuối cựng khi thu hoạch cú chứa 1-NAA. Khi thu hoạch, hỗn hợp gồm tế bào và mụi trường, được lọc qua giấy lọc, thu lấy sinh khối được. Sinh khối được rửa nhiều lần với nước cất (tỷ lệ nước cất : sinh khối, 5:1), rồi được sấy khụ tới khối lượng khụng đổi. Xỏc định hàm lượng hoạt chất và 1-NAA trong cỏc mẫu. Từ đú xỏc định