d/ Nồng độ oxy hoà tan.
3.1.3. Kết quả nuụi cấy trong mụi trường lỏng
Sau khi callus SNL nuụi cấy trờn mụi trường thạch, tế bào đó mềm, xốp và khụng cũn khả năng biệt húa được cấy chuyển sang mụi trường lỏng trờn hệ thống shaker và bioreactor nhằm mục đớch tăng sinh khối lượng tế bào. Quỏ trỡnh cấy chuyển tế bào sang mụi trường lỏng tiến hành trong điều kiện vụ khuẩn. Nuụi cấy tế bào trong bỡnh cầu 250ml ở điều kiện khụng cú ỏnh sỏng. Sau 4-5 ngày nuụi cấy cỏc tế bào bắt đầu phỏt triển và tỏch rời nhau ra khỏi khối callus (hỡnh 3.3).
74
Hỡnh 3.3. Tế bàoSNL trờn mụi trường thạch (A); trong mụi trường lỏng (B)
3.1.3.1. Ảnh hưởng của thời gian nuụi cấy
Từ cỏc kết quả nuụi cấy trờn mụi trường thạch, chỳng tụi lựa chọn mụi trường lỏng MS cú bổ xung NAA 1,5mg/l, kinetin 0,1mg/l và 30 gam saccarose. Sau ngày thứ 2; 4; 6; 8; 10; 12; 14; 16; 18 thu hoạch tế bào, sấy khụ, cõn xỏc định khối lượng tế bào. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.9.
Bảng 3.9. Tốc độ phỏt triển của tế bào SNL trờn mụi trường lỏng
Ngày Khối lượng khụ (g/l)
Ngày Khối lượng khụ (g/l) 1 6,03±0,21 10 12,89±0,35 2 6,15±0,47 12 14,02±0,24 4 6,58±0.12 14 14,93±0,35 6 9,42±0,41 16 14,72±0,79 8 10,57±0,55 18 14,31±0,76
Từ kết quả bảng 3.9, cho thấy sau ngày nuụi cấy thứ 4 cỏc tế bào đó bắt đầu phỏt triển, khối lượng tế bào sõm tăng nhanh từ ngày thứ 4 đến ngày 14. Từ ngày thứ 14 đến ngày thứ 16 tốc độ tăng chậm dần và sau ngày thứ 16 thỡ khối lượng sõm gần như khụng tăng, thậm chớ cũn giảm, tế bào cú hiện tượng sẫm màu. Nguyờn nhõn là do trong mụi trường đó hết cỏc chất dinh dưỡng để nuụi tế bào, nếu muốn tiếp tục phỏt triển cần phải cấy chuyển tế bào sang mụi trường mới. Như vậy khi cấy chuyển sang mụi trường lỏng tế bào phỏt triển với tốc độ nhanh hơn, vỡ vậy thời gian cho 1 chu kỡ nuụi cấy đó rỳt ngắn xuống chỉ cũn 14 ngày, trong khi nuụi cấy trờn mụi trường thạch là 35 ngày. Kết quả nghiờn cứu của chỳng tụi cũng giống với cỏc nghiờn cứu về thời gian nuụi cấy sõm Hàn Quốc của tỏc giả Sang Yo Buyn và cs (2001) [68] là 14 ngày, sõm Mỹ là 16 ngày [61].
75
Kết quả khảo sỏt ảnh hưởng của thời gian cho thấy tỷ lệ tăng trưởng khi nuụi cấy trờn mụi trường lỏng cũn thấp khoảng 3,09 lần thấp hơn so với nuụi cấy trờn mụi trường thạch (tỷ lệ tăng trưởng khi nuụi tế bào trờn mụi trường thạch khoảng 5,38 lần), cỏc tế bào vẫn chưa mịn màng, chỳng vẫn liờn kết với nhau thành từng khối. Điều này cú thể là do khi cấy chuyển từ mụi trường thạch sang mụi trường lỏng tế bào chưa thớch nghi ngay với mụi trường và điều kiện nuụi cấy.
Chỳng tụi tiến hành cỏc thớ nghiệm đỏnh giỏ khả năng thớch nghi tế bào với điều kiện nuụi cấy trờn mụi trường lỏng bằng cỏch cấy chuyển tế bào nhiều lần trờn cựng loại mụi trường. Kết quả được trỡnh bày trong bảng 3.10.
Bảng 3.10. Tốc độ phỏt triển tế bào sau cỏc lần cấy chuyển
Khối lượng tế bào sõm (x±SD) Lần cấy chuyển n KLT (g/l) KLK (g/l) Tỷ lệ tăng trưởng Lần 1 10 219,25±10,57 14,72±0,79 3,09±0,04 Lần 2 10 237,67±7,54 15.83±0,57 3,38±0,05 Lần 3 10 259,12±8,57 17.33±0,43 3,71±0,04 Lần 4 10 262,14±6,93 17.46±0,67 3,74±0,01
Từ kết quả bảng 3.10 cho thấy, cỏc lần cấy chuyển thứ 2 và thứ 3 tốc độ phỏt triển của tế bào tăng hơn so với cỏc lần trước và khụng tăng thờm khi cấy chuyển đến lần thứ 4. Cỏc tế bào sau lần cấy chuyển thứ 3 khụng cũn liờn kết với nhau nữa, hỡnh thỏi cỏc tế bào sỏng, màng tế bào mỏng.
Như vậy đối với giai đoạn đầu nuụi cấy trong mụi trường lỏng, tế bào SNL phải mất 3-4 lần cấy chuyển thỡ tế bào mới thớch nghi được trong điều kiện nuụi cấy mới.
3.1.3.2. Ảnh hưởng của pH mụi trường nuụi cấy.
Mụi trường lựa chọn khảo sỏt là MS cú bổ sung NAA 1,5mg/l và kinetin 0,2mg/l. Khoảng pH thay đổi từ 5,2 đến 6,4. Sau 14 ngày nuụi cấy kết quả trỡnh bày ở bảng 3.11.
76
Bảng 3.11. Ảnh hưởng của pH mụi trường
Khối lượng tế bào sõm (x±SD) pH n KLT (g/l) KLK (g/l) Tỷ lệ tăng trưởng 5,2 (1) 9 212,51±2,18 12,86±0,43 3,41±0,02 5,4 (2) 9 221,53±4,42 16,54±0,43 3,51±0,02 5,6 (3) 9 249,12±8,57 17.13±0,43 3,67±0,04 5,8 (4) 9 262,14±6,93 17.46±0,67 3,74±0,01 6,0 (5) 9 231,53±4,42 15,54±0,43 3,41±0,02 6,2 (6) 9 175,27±5,29 11,56±0,34 2,56±0,12 6,4 (7) 9 168.15 ±6,83 11,21±0,30 2,27±0,21 p P3-1<0,05 ; p3-2<0,05 ; p3-4>0,05 ; p3-5 <0,05 ; p3-6 <0,05
Từ kết qủa ở bảng 3.11 cho thấy khi pH mụi trường nuụi cấy càng tăng thỡ tốc độ phỏt triển của tế bào giảm. Ở khoảng pH từ 6,0 đến 6,4 mức độ giảm là cú ý nghĩa thống kờ với p<0,05 so với khoảng pH từ 5,6-5,8.
Ở khoảng pH từ 5,6 đến 5,8 thỡ tốc độ phỏt triển tế bào tốt nhất với tỷ lệ tăng trưởng đạt 3,67 đến 3,74 lần. Điều này cho thấy SNL sinh khối cú khả năng thớch nghi với khoảng pH mụi trường từ 5,6 – 5,8. Với khoảng pH mụi trường đú tế bào phỏt triển tốt nhất, khối lượng cao nhất đạt từ 17,13 g/l đến 17,46 g/l.
Kết quả nghiờn cứu của chỳng tụi phự hợp với cỏc kết quả nghiờn cứu SKTB sõm Mỹ (Panax quinquefolius L.), sõm Hàn Quốc (Panax ginseng), Tam thất (Panax notoginseng) [ 83],[84].
3.1.3.3. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuụi cấy
Khảo sỏt ảnh hưởng của nhiệt độ tới tốc độ phỏt triển của tế bào SNL khi nuụi cấy trờn mụi trường lỏng. Chỳng tụi sử dụng mụi trường nuụi cấy MS bổ xung 1,5mg/l NAA, 0,2 mg/l kinetin và 30 gam đường, điều chỉnh pH mụi trường trước khi hấp là 5,8. Kết quả khảo sỏt trỡnh bày ở bảng 3.12.
77
Bảng 3.12. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuụi cấy
Khối lượng tế bào sõm (x±SD) Nhiệt độ (0C) n KLT (g/l) KLK (g/l) Tỷ lệ tăng trưởng 20 (1) 9 201,71±8,59 13,35±0,38 3,05±0,05 22 (2) 9 234,12±5,34 15,40±0,23 3,43±0,02 24 (3) 9 262,14±6,93 17,46±0,67 3,74±0,01 26 (4) 9 253,56±4,67 16,43±0,21 3,57±0,02 28 (5) 9 177,13±4,35 12,12±0,34 2,45±0,04 30 (6) 9 153,93±6,86 9,83±0,52 2,04± 0,05 p p2-1<0,05 ; p3-2<0,05 ; p2-4<0,05
Khi nuụi cấy ở nhiệt độ thấp, tốc độ phỏt triển của tế bào chậm (ở 200C tỷ lệ tăng trưởng đạt 3,05 lần), khi nhiệt độ tăng dần thỡ tốc độ phỏt triển tế bào tốt hơn và ở khoảng nhiệt độ từ 24-260C tỷ lệ tăng trưởng là tụt nhất đạt 3,57 đến 3,74 lần. Tuy nhiờn, nếu tiếp tục tăng nhiệt độ nuụi cấy trờn 280C thỡ cỏc tế bào lại phỏt triển chậm lại, một sụ tế bào cú hiện tượng bị biển đổi màu sắc. Như vậy nhiệt độ thớch hợp cho nuụi cấy sinh khối là từ 24 – 260C.
3.1.3.4. Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng
Lựa chọn 4 loại chất điều tiết sinh trưởng khỏc nhau thuộc nhúm auxin là 2,4- diclorophenoxy acetic acid (2,4-D); Indol butyric acid (IBA) và NAA nồng độ ban đầu 1,5 mg/l, dựng riờng lẻ hay kết hợp với Kinetin (nhúm cytokinin) nồng độ 0,2mg/l bổ sung vào trong mụi trường nuụi cấy. Kết quả được trỡnh bày trong bảng 3.13.
Bảng 3.13. Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng tới sự sinh trưởng tế bào
Khối lượng tế bào (x ± SD) Chất điều tiết sinh
trưởng n KLT (g/l) KLK (g/l) Tỷ lệ tăng trưởng 2,4-D (1) 9 168,15 ± 6,83 11,21 ± 0,30 2,27 ± 0,21 NAA (2) 9 185,45 ± 7,36 12,93 ± 0,21 2,67 ± 0,13 IBA (3) 9 172,35 ± 5,78 11,49 ± 0,36 2,54 ± 0,11 2,4-D + Kinetin (4) 9 278,50 ± 9,13 16,50 ± 0,42 3,69 ± 0,04 NAA + Kinetin (5) 9 262,14 ± 6,93 17,46 ± 0,67 3,74 ± 0,01 IBA +Kinetin (6) 9 187,25±5,28 12,75±0,15 2,79 ± 0,07 p p5-1<0,05; p5-2<0,05; p5-3<0,05; p5-4 > 0,05; p5-6 < 0,05
78
Từ kết quả bảng 3.13 cho thấy sử dụng cỏc chất điều tiết sinh trưởng thuộc hai nhúm riờng lẻ cho kết quả thấp hơn so với phối hợp 2 nhúm khỏc nhau (p5-1<0,05 ; p5-2<0,05 ; p5-3<0,05). Trong cỏc phối hợp thỡ sử dụng cặp phối hợp NAA hoặc 2,4-D với Kinetin cho hiệu suất tốt hơn với p5-6 < 0,05. Sử dụng cặp phối hợp NAA+ Kinetin và cặp 2,4-D + Kinetin thấy khụng cú sự khỏc biệt về khối lượng tế bào thu hoạch được với p > 0,05.
Trong SKTB thực vật, nuụi cấy trờn mụi trường lỏng là giai đoạn quan trọng, quyết định đến hiệu suất, hàm lượng hoạt chất. Trong cỏc yếu tố ảnh hưởng thỡ thành phần mụi trường đúng vai trũ quyết định. Cỏc chất điều tiết sinh trưởng liờn quan đến tốc độ phỏt triển của tế bào cũng như sự hỡnh thành cỏc sản phẩm chuyển húa thứ cấp.
Trong cỏc nghiờn cứu trước đõy cho thấy việc phối hợp chất điều tiết sinh trưởng cho hiệu quả cao hơn dựng riờng lẻ từng chất. Điều này được giải thớch là sự tỏc động đồng thời nhiều cơ chế khỏc nhau khỏc nhau làm thỳc đẩy nhanh sự phõn chia tế bào cũng như cỏc con đường chuyển húa tạo sản phẩm thứ cấp.
Kết quả nghiờn cứu của chỳng tụi cho thấy sử dụng phối hợp NAA với kinetin hoặc cặp 2,4-D với kinetin làm chất điều tiết sinh trưởng cho nuụi cấy tế bào SNL trờn mụi trường lỏng cho hiệu quả cao hơn khi sử dụng từng chất riờng lẻ. Tuy nhiờn 2,4-D là dẫn chất Dioxin rất độc và khả năng phõn hủy chậm, vỡ vậy trong nghiờn cứu này chỳng tụi sử dụng cặp phối hợp NAA và kinetin trong cỏc nghiờn cứu tiếp theo về tối ưu húa mụi trường.