d/ Nồng độ oxy hoà tan.
3.1.2. Phương phỏp duy trỡ nuụi cấy callus trờn mụi trường thạch
3.1.2.1. Khảo sỏt sự thớch nghi của tế bào trờn mụi trường thạch
Chỳng tụi tiến hành nuụi cấy duy trỡ trờn mụi trường MS cú bổ xung chất điều tiết sinh trưởng là NAA và kinetin. Tiến hành cấy chuyển 4 lần (mỗi lần nuụi cấy là 35 ngày). Sau cỏc lần cấy chuyển, theo dừi hỡnh thỏi, tớnh chất biệt húa của tế bào và xỏc định tỷ lệ tăng trưởng. Kết quả được trỡnh trong bảng 8 và hỡnh 13
Bảng 3.5. Đặc tớnh của tế bào sau cỏc lần cấy chuyển
Lần cấy
chuyển Hỡnh thỏi tế bào Khả năng biệt húa
Tỷ lệ tăng trưởng Lần 1 Tế bào cứng Biệt húa thành rễ, và
thõn 3,57±0,23
Lần 2 Tế bào cứng, cú một số
đó mềm mại
Biệt húa thành cỏc
mụ sẹo 4,23±0,31
Lần 3 Tế bào mềm mại Khụng cũn biệt húa 4.78±0.14
70
Callus sõm sau khi đó tạo ra trờn mụi trường thạch mềm, cỏc tế bào cũn cứng và tiếp tục biệt húa thành thành cỏc cơ quan tổ chức khỏc như rễ, thõn cõy. Vỡ vậy cần phải cú giai đoạn duy trỡ nuụi cấy trờn mụi trường thạch trong một thời gian nhất định, đảm bảo tế bào khụng cũn biệt húa, ngoài ra tế bào phải cú hỡnh thỏi mềm, xốp thớch hợp cho việc nuụi cấy trờn mụi trường lỏng. Duy trỡ nuụi cấy tạo callus trờn mụi trường thạch là giai đoạn chuyển tiếp của quy trỡnh sinh khối. Từ callus chỳng cú thể bị biệt húa trở lại tạo ra cỏc mụ, cơ quan khỏc nhau và cú thể hỡnh thành những cõy mới tựy theo tỏc động của điều kiện nuụi cấy và thành phần mụi trường. Kết quả nghiờn cứu cho thấy ở lần cấy chuyển đầu tiờn, tế bào cũn cứng, một số cú dấu hiệu biệt húa thành cỏc cơ quan chuyờn biệt như rễ, thõn. Sau lần cấy thứ 2 cỏc tế bào đó ớt biệt húa hơn tuy nhiờn tế bào vẫn chưa mềm mại. Tiếp tục cấy chuyển đến lần thứ 3 và 4 thỡ tế bào hoàn toàn khụng cũn khả năng biệt húa, cỏc tế bào mềm, xốp, khối lượng tế bào tăng nhiều.
Hỡnh 3.2. Callus SNL sau cỏc lần cấy chuyển trờn mụi trường thạch
A: cấy chuyển lần 1; B: cấy chuyển lần 2; C: cấy chuyển lần 3; D: cấy chuyển lần 4
A B
71
Tốc độ sinh trưởng của tế bào qua cỏc lần cấy chuyển cũng thay đổi, ở những lần cấy chuyển đầu tiờn tế bào phỏt triển chậm với tỷ lệ tăng trưởng khoảng 3,5 lần. Tuy nhiờn cỏc lần cấy chuyển tiếp theo tốc độ phỏt triển cao hơn với tỷ lệ tăng trưởng của lần thứ 2 là 4,23 lần và lần cấy thứ 3 là 4.78 lần. Điều này cho thấy sau khi cấy chuyển nhiều lần cỏc tế bào mới dần thớch nghi với thành phần mụi trường mới. Với tế bào SNL sau lần cấy chuyển thứ 4 thỡ tốc độ phỏt triển ổn định. Kết quả nghiờn cứu của chỳng tụi cũng giống với cỏc tỏc giả nước ngoài nghiờn cứu vế sinh khối cỏc loài sõm khỏc [38],[ 51]
3.1.2.2. Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng NAA
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của nồng độ NAA đến tốc độ phỏt triển tế bào
Khối lượng tế bào sõm (x±SD) Nồng độ NAA (mg/l) n KLT (g) KLK (g) Tỷ lệ tăng trưởng 0,5 (1) 35 33,09±1,71 1,31±0,08 3,29±0,22 1,0 (2) 40 42,78±1,49 1,65±0,07 4,12±0,17 1,5 (3) 49 53,58±2,71 2,15±0,09 5,38±0,24 2,0 (4) 48 52,72±2,23 2,13±0,11 5,34±0,29 2,5 (5) 48 52,55±2,22 2,15±0,14 5,37±0,36 p p3-1<0,05 ; p3-2<0,05 ; p3-4>0,05 ; p3-5 >0,05
Trong quỏ trỡnh duy trỡ nuụi cấy khối tế bào sõm, nhất thiết phải sử dụng cỏc chất điều tiết sinh trưởng đặc biệt cỏc chất thuộc nhúm Auxin. Đõy là những chất giỳp cho quỏ trỡnh phõn chia tế bào nhanh hơn, đồng thời cú thể làm hạn chế quỏ trỡnh biệt húa của tế bào. Vỡ vậy cần phải chọn được chất nào phự hợp nhất và nồng độ tối ưu nhất. Qua khảo sỏt chỳng tụi đó lựa chọn được NAA là chất điều tiết sinh trưởng phự hợp. Tuy nhiờn, khi sử dụng NAA ở cỏc nồng độ từ 0,5 mg/l đến 2,5 mg/l thỡ tốc độ phỏt triển của tế bào cũng thay đổi. Kết quả bảng 9, biểu đồ 3 cho thấy khối lượng callus của nhúm dựng NAA với nồng độ 1.5 mg/l là cao hơn so vơi nhúm NAA ở mức 0,5mg/l và 1,0 mg/l sự khỏc biệt cú ý nghĩa thống kờ (p<0,05) . Tuy nhiờn, ở cỏc nhúm dựng NAA, nồng độ 2,0 mg/l và 2,5 mg/l so với nhúm dựng nồng độ 1,5 mg/l, khối lượng của tế bào khụng khỏc biệt với p>0,05. Như vậy nồng độ NAA thớch hợp dựng cho duy trỡ nuụi cấy callus SNL là 1,5 mg/l. Kết quả này cũng phự hợp với một số nghiờn cứu khỏc dựng NAA với nồng độ từ 0,5 – 5mg/l trong nghiờn cứu nuụi cấy sõm Hàn Quốc, sõm Mỹ [38],[ 61].
72
3.1.2.3. Ảnh hưởng của pH mụi trường
Để đỏnh giỏ ảnh hưởng của mụi trường nuụi cấy đến tốc độ phỏt triển của tế bào SNL, trong giai đoạn duy trỡ nuụi cấy trờn mụi trường thạch mềm, chỳng tụi sử dụng mụi trường nuụi cấy MS cú bổ sung 1,5mg/l NAA, 0,1 mg/l kinetin và 30 gam saccarose. Điều chỉnh pH mụi trường trước khi tiệt khuẩn ở cỏc giỏ trị 5,0 ; 5,4 ; 5,8 ; 6,2 ; 6,6. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.7.
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của pH mụi trường tới sự sinh trưởng của tế bào sõm
Khối lượng tế bào sõm (x±SD) pH n KLT (g) KLK (g) Tỷ lệ tăng trưởng 5,0 (1) 16 21,91±1,61 0,83±0,08 2,06±0,22 5,4 (2) 30 38,81±1,72 1,56±0,07 3,09±0,19 5,8 (3) 48 53,15±2,65 2,15±0,15 5,38±0,38 6,2 (4) 25 38,89±1,45 1,54±0,09 3,86±0,22 6,6 (5) 11 18,16±1,94 0,66±0,06 1,64±0,16 p p3-1<0,05 ; p3-2<0,05 ; p3-4<0,05 ; p3-5 <0,05
Kết quả nghiờn cứu từ bảng 3.7, cho thấy tốc độ phỏt triển của callus SNL pH mụi trường = 5,8 là cao nhất với tỷ lệ tăng trưởng đạt 5,38 lần, trong khi ở pH = 5,0 ; 5,4 ; 6,2 tỷ lệ tăng trưởng lần lượt là 2,06 ; 3,09 và 3,86 lần. Đặc biệt khi nuụi cấy ở khoảng pH =6,6 tế bào khụng phỏ triển được, một số bị chuyển mầu nõu sẫm và cú hiện tượng tế bào bị chết.
Ngoài ảnh hưởng của thành phần mụi trường nuụi cấy thỡ điều kiện nuụi cấy đúng vai trũ quyết định đến tốc độ sinh trưởng của tế bào. Trong số cỏc yếu tố đú pH mụi trường nuụi cấy quyết định sự thành cụng trong nuụi cấy tạo callus. Nếu pH mụi trường quỏ cao hoặc quỏ thấp thỡ hiệu quả nuụi cấy khụng cao, tế bào sinh trưởng chậm hoặc bị chết. Kết quả nghiờn của chỳng tụi cho thấy pH thớch hợp để duy trỡ callus SNL trờn mụi trường thạch mềm là 5,8.
3.1.2.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuụi cấy
Sử dụng mụi trường nuụi cấy MS cú bổ sung 1,5mg/l NAA, 0,1 mg/l kinetin và 30 gam saccarose, pH =5,8 để khảo sỏt ảnh hưởng của nhiệt độ nuụi cấy tới tốc độ phỏt triển của tế bào. Tiến hành nuụi cấy trong điều kiện khụng cú ỏnh sỏng trong thời gian 35 ngày, ở cỏc khoảng nhiệt độ từ 19 đến 290C. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.8.
73
Bảng 3.8 Ảnh hưởng của nhiệt độ phũng nuụi cấy tới tốc độ phỏt triển của tế bào
Khối lượng tế bào sõm (x±SD) Nhiệt độ (°C ) KLT (g) KLK (g) Tỷ lệ tăng trưởng 19-21 (1) 15 26,43±1,01 1,02±0,11 2,56±0,28 21-23 (2) 27 37,61±2,10 1,54±0,15 3,38±0,37 23-25 (3) 49 53,40±2,63 2,15±0,10 5,36±0,27 25-27 (4) 30 34,91±1,58 1,33±0,10 3,33±0,26 27-29 (5) 17 16,97±1,37 0,67±0,05 1,67±0,13 p p3-1<0,05 ; p3-2<0,05 ; p3-4<0,05 ; p3-5 <0,05 Từ kết quả bảng 3.8, cho thấy khối lượng callus SNL trong nhúm nuụi cấy ở khoảng nhiệt độ từ 23-25°C cao hơn cỏc nhúm khỏc, sự khỏc biệt cú ý nghĩa (p < 0,05). Tỷ lệ tăng trưởng của khối tế bào khi nuụi cấy ở nhiệt độ 23- 25°C đạt 5,36 lần, trong khi nuụi cấy ở nhiệt độ từ 19 – 230C thỡ tỷ lệ tăng trưởng tế bào đạt 2,56 và 3,38 lần. Khi tăng nhiệt độ nuụi cấy tới 27-290C cỏc tế bào phỏt triển chậm, một số bị biến màu sau 7 ngày nuụi cấy, mật độ tế bào thưa và tỷ lệ tăng trưởng đạt 1,67 lần thấp hơn so với cỏc khoảng nhiệt độ khỏc. Sự khỏc biệt này cú nghĩa thống kờ với p<0,05
Nhiệt độ nuụi cấy cú vai trũ quan trọng, ảnh hưởng đến cỏc quỏ trỡnh sinh lớ, sinh húa của tế bào. Nếu nhiệt độ nuụi cấy quỏ thấp cỏc quỏ trớnh này sẽ chậm lại dẫn đến cỏc tế bào phỏt triển chậm, tuy nhiờn nếu tăng nhiệt độ nuụi cấy quỏ cao, tế bào thực vật cú thể chết do cỏc enzym bị mất hoạt tớnh dẫn đến cỏc tế bào sẽ chết. Trong nuụi cấy, cỏc tế bào thực vật thường cú khoảng nhiệt độ thớch nghi hẹp từ 20 – 300C khỏc với cỏc tế bào khi cũn tồn tại trờn cõy. Qua kết quả nghiờn cứu cho thấy ở nhiệt độ khoảng 23-25°C là tốt nhất đối với nuụi cấy tạo và duy trỡ SKTB SNL.