d/ Nồng độ oxy hoà tan.
3.1.1.Nuụi cấy tạo callus
3.1.1.1. Lựa chọn mụi trường nuụi cấy
Chỳng tụi lựa chọn 4 loại mụi trường khỏc nhau để nuụi cấy callus: mụi trường MS, White, Gamborg và Nitsch cú bổ sung 0,5mg/l 2,4-D và 0,1mg/l kinetin. Sau 35 ngày nuụi cấy callus sõm được hỡnh thành (hỡnh 3.1.A và 3.1.B), tỷ lệ tạo thành callus trờn cỏc mụi trường được trỡnh bày trong bảng 3.1.
3.1.A. Rễ sõm Ngọc Linh tự nhiờn 3.1.B. Callus sõm Ngọc Linh
Hỡnh 3.1. Rễ và callus sõm Ngọc Linh
Bảng 3.1. Kết quả tạo thành callus trờn cỏc loại mụi trường sau 35 ngày
Mụi trường nuụi cấy Số mẫu thực nghiệm Số mẫu tạo thành callus Tỷ lệ thành cụng (%) MS (1) 100 40 40 White (2) 100 25 25 Gamborg (3) 100 15 15 Nitsch (4) 100 13 13 p p2-1<0,05; p3-1 <0,05; p4-1<0,05
Trong nghiờn cứu này với mục đớch tạo ra SNL sinh khối trong quy mụ phũng thớ nghiệm, chỳng tụi đó thành cụng trong việc nuụi cấy SKTB rễ SNL
67
bằng cỏch sử dụng 4 loại mụi trường khỏc nhau. Tuy nhiờn, kết quả tạo thành callus trờn cỏc mụi trường khụng giống nhau. Trong đú mụi trường Murashige Skoog (MS) cho tỷ lệ tạo callus cao nhất 40%, mụi trường Nitsch cho tỷ lệ thấp nhất 13%. Hỡnh thỏi callus trờn cỏc mụi trường khỏc nhau cũng khụng giống nhau, callus mọc trờn mụi trường MS tế bào màu vàng nhạt, tươi và sỏng khụng bị nhiễm khuẩn. Callus mọc trờn 3 mụi trường khỏc cú màu nõu xẫm, tế bào phỏt triển chậm.
Kết quả xỏc định khối lượng callus sau 35 ngày nuụi cấy được trỡnh bày trong bảng 3.2.
Bảng 3.2. Khối lượng callus trong cỏc mụi trường khỏc nhau
Khối lượng callus sõm (x±SD) Mụi trường n KLT (mg) KLK (mg) MS (1) 40 290,47±20,10 62,93±3,62 White (2) 25 145,76± 14,42 26,34±2,57 Gamborg (3) 13 179,86±23,25 33,29±2,78 Nitsch (4) 15 150,87±12,79 27,10±2,24 P p2-1<0,05; p3-1 <0,05; p4-1<0,05
Khối lượng callus khi nuụi cấy trờn cỏc mụi trường khỏc nhau cú tốc độ phỏt triển khụng giống nhau. Ở mụi trường MS tế bào phỏt triển nhanh nhất sau 35 ngày nuụi cấy đạt 290,47 mg tươi, cao hơn 3 mụi trường cũn lại với p<0,05. Như vậy chứng tỏ mụi trường MS là phự hợp cho sự hỡnh thành và phỏt triển của callus SNL.
3.1.1.2. Ảnh hưởng của thời gian nuụi cấy
Sau khi lựa chọn được mụi trường MS nuụi cấy callus, chỳng tụi tiến hành khảo sỏt tốc độ phỏt triển của callus trong khoảng thời gian từ ngày thứ 15 đến ngày thứ 45. Kết quả nghiờn cứu tốc độ phỏt triển callus sõm theo thời gian được thể hiện ở bảng 3.3.
Bảng 3.3. Tốc độ tăng trưởng của callus sõm theo thời gian
Thời gian nuụi cấy (ngày) Khối lượng
15 20 25 30 35 40 45 KLT (mg) 140±9,3 235±13,5 274±14.2 295±12,3 323±16,3 317±10,3 315±16,4 KLT (mg) 140±9,3 235±13,5 274±14.2 295±12,3 323±16,3 317±10,3 315±16,4 KLK (mg) 21±1,3 36±1,1 58±0,9 74±0,7 78± 1,2 75±1,1 72±0,7
68
Sau khi cấy tạo callus trờn mụi trường thạch mềm, sau ngày thứ 10 cỏc mụ tỏch ra từ rễ cõy tự nhiờn bắt đầu xuất hiện callus và từ ngày thứ 15 đến ngày thứ 35 khối lượng của callus sõm tăng nhanh, sau ngày thứ 35 mức độ tăng chậm lại. đến ngày thứ 40 khối lượng callus gần như khụng tăng.
Trong kỹ thuật SKTB thực vật xỏc định thời điểm callus sõm sinh trưởng cao nhất là một trong những yếu tố quan trọng. Nếu chọn thời điểm thu hoạch chậm hoặc nhanh quỏ thỡ hiệu quả khụng cao. Nếu thu hoạch nhanh thỡ lóng phớ vỡ callus sõm cũn cú thể tiếp tục sinh trưởng được, nếu thu hoạch muộn thỡ tốn kộm và khụng tiết kiệm được thời gian, thậm chớ tế bào sõm cú thể bị chết hoặc đổi màu do chất dinh dưỡng trong mụi trường đó cạn kiệt [36].
Kết quả nghiờn cứu cho thấy, thời điểm thớch hợp nhất là thời điểm ngày thứ 35, sớm hơn so với thời điểm thu hoạch của sõm Hàn Quốc (35-40 ngày) [63].
3.1.1.3. Khảo sỏt ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng
Từ cỏc kết quả nghiờn cứu thu được, chỳng tụi lựa chọn mụi trường MS để khảo sỏt ảnh hưởng của cỏc chất điều tiết sinh trưởng tới tốc độ phỏt triển của callus. Lựa chọn 4 loại chất điều tiết sinh trưởng khỏc nhau NAA; 2,4-D; IAA và IBA thuộc nhúm auxin với nồng độ là 0,5mg/l kết hợp với kinetin 0,1mg/l (thuộc nhúm cytokinin). Sau 35 ngày nuụi cấy, thu hoạch callus cõn xỏc định khối lượng tế bào tươi và tế bào khụ. Kết quả được trỡnh bày trong bảng 3.4.
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của chất điều tiết sinh trưởng đến sự hỡnh thành callus
Khối lượng callus sõm (x ± SD) Loại chất n
Khối lượng tươi (mg) Khối lượng khụ (mg) Chứng (1) 39 103,92 ± 7,39 17,64 ± 2,24 2,4 D (2) 40 290,47 ± 21,20 65,92 ± 3,31 NAA (3) 38 315,25 ± 20,09 67,08 ± 3,41 IAA (4) 41 267,67 ± 21,95 19,12 ± 2,02 IBA (5) 40 259,18 ± 16,14 18,51 ± 2,75 P p3-1<0,05; p3-2>0,05; p3-4<0,05; p3-5<0,05
69
Chất điều tiết sinh trưởng đúng vai trũ quan trọng đối với sự phỏt triển của tế bào, đặt biệt cỏc tế bào mới bị tỏch ra khỏi cơ thể. Nú giỳp duy trỡ qỳa trỡnh phõn chia tế bào đồng thời gúp phần tăng sinh mụ sẹo, để hàn gắn cỏc tổn thương khi bị tỏc động từ bờn ngoài. Thực nghiệm cho thấy với mụi trường khụng dựng chất điều tiết sinh trưởng thỡ tế bào gần như khụng phỏt triển (nhúm chứng) sau 35 ngày nuụi cấy, trong khi cỏc nhúm cú sử dụng chất điều tiết sinh trưởng thỡ tế bào vẫn phỏt triển, tuy nhiờn mức độ khỏc nhau. Mụi trường cú sử dụng NAA và 2,4-D tốc độ phỏt triển của callus là tốt hơn mụi trường sử dụng IAA, IBA với p<0,05. Sự khỏc biệt khụng cú nghĩa thống kờ khi sử dụng NAA và 2,4-D cho nuụi cấy tạo callus. Tuy nhiờn 2,4-D là dẫn chất Dioxin cú độc tớnh cao, thời gian bỏn hủy dài ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng, vỡ vậy chỳng tụi lựa chọn NAA là chất điều tiết sinh trưởng cho nuụi cấy tạo callus SNL.
Cỏc callus cú đặc điểm hỡnh thỏi tế bào và tốc độ phỏt triển tốt được cấy chuyển từ ống thạch mềm sang bỡnh thạch mềm cú thể tớch lớn hơn để cho tế bào phỏt triển tốt hơn. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});