2. PHƯƠNG PHÁP THỬ
2.4. Tro khụng tan trong acid: tiến hành theo phương phỏp 1, PL-7.5, DĐVN III.
DĐVN III.
2.5. Định tớnh:
2.5.1. Theo phương phỏp sắc ký lớp mỏng:
* Cỏch thử:
- Dung dịch đối chiếu: Lấy 0,5g bột SNL, thờm 30ml cloroform, đun sụi hồi lưu trong cỏch thủy 1 giờ, loại bỏ dịch chiết cloroform. Đuổi hết hơi cloroform trong cắn bằng cỏch đun núng nhẹ trờn bếp cỏch thủy, thờm vào cắn 30ml n-butanol, lắc siờu õm 30 phỳt, lọc. Chuyển dịch lọc vào bỡnh gạn, lắc với 20ml dung dịch amoniac 10%, gạn lấy lớp butanol, cụ trờn cỏch thuỷ đến cạn. Hoà cắn trong 1ml ethanol tuyệt đối được dung dịch chấm sắc ký.
- Dung dịch thử: 0,5g bột sinh khối, thờm 30ml cloroform, đun sụi hồi lưu cỏch thủy trong 1 giờ, loại bỏ dịch chiết cloroform. Đuổi hết hơi cloroform ở lớp nước bằng cỏch đun núng nhẹ trờn bếp cỏch thủy, lắc kỹ lớp nước với 30ml n-butanol. Gạn lấy dịch chiết butanol, lắc với 20ml dung dịch amoniac 10%. Gạn lấy lớp butanol, cụ trờn cỏch thuỷ đến cạn. Hoà cắn trong 1ml ethanol tuyệt đối được dung dịch chấm sắc ký.
Chấm riờng biệt lờn bản mỏng 10 àl mỗi dung dịch đối chiếu và dung dịch thử thành 2 vạch (mỗi vạch dài khụng quỏ 1cm, rộng khụng quỏ 0,3cm). Tiến hành sắc ký lớp mỏng theo DĐVN III - phụ lục 4,4. Sau khi triển khai được khoảng 12-14 cm, lấy bản mỏng ra, để khụ ở nhiệt độ phũng rồi phun thuốc thử hiện màu, sấy bản mỏng ở 1200C đến khi hiện rừ vết,
Yờu cầu: Dung dịch thử phải cú cỏc vết cựng màu, cựng Rf với cỏc vết của dung dịch đối chiếu.
2.5.2. Định tớnh Rg1, Rd và Rb1 theo phương phỏp HPLC
Trong phần định lượng, sắc ký đồ của dung dịch thử phải cú cỏc pớc cựng thời gian lưu với cỏc pớc ginsenosid Rg1, ginsenosid Rb1 và ginsenosid Rd trong sắc ký đồ của cỏc dung dịch ginsenosid Rg1, ginsenosid Rb1 và ginsenosid Rd chuẩn.
2.6. Định lượng
Định lượng ginsenosid Rg1, ginsenosid Rb1 và ginsenosid Rd bằng phương phỏp HPLC.
113
- Cột Apollo C18 (5àm, 25cm x 4mm) hoặc cột tương đương. - Pha động:
+ Dung mụi A: Hỗn hợp Acetonitril - nước (8:2).
+ Dung mụi B: Nước.
Chương trỡnh pha động (bảng 3.36):
Bảng 3.36. Chương trỡnh pha động định lượng cỏc ginsenosid
Thời gian (phỳt) Dung mụi A Dung mụi B
0 --> 25 22 78 25 --> 40 22 --> 35 78 --> 65 40 --> 75 35 --> 42 65 --> 58 75 --> 80 42 --> 100 58 --> 0 80 --> 85 100 --> 22 0 -->78 85 --> 95 22 78 - Tốc độ dũng: 2 ml/phỳt. - Detector UV ở bước súng 203 nm. - Thể tớch tiờm: 10 àl.
Chuẩn bị dung dịch thử và dung dịch chuẩn:
- Dung dịch thử:
Cõn chớnh xỏc khoảng 1 g chế phẩm vào bỡnh nún cú nỳt mài 100 ml, thờm chớnh xỏc 50 ml methanol, đậy nỳt, cõn chớnh xỏc khối lượng. Đun sụi hồi lưu cỏch thủy trong 1 giờ, để nguội, cõn xỏc định lại khối lượng, thờm methanol để bổ sung khối lượng mất đi (nếu cần). Ly tõm, hỳt chớnh xỏc 25 ml dịch ly tõm, cụ trờn cỏch thủy đến cạn.
Hũa cắn trong 5ml nước, chuyển vào cột chiết xuất pha rắn (C18, 360 mg đó được hoạt hoỏ lần lượt với 5 ml MeOH, 5 ml MeOH 50%, 5 ml nước). Mở khoỏ, cho dung dịch chảy qua cột với tốc độ 20-25 giọt/phỳt. Khi dung dịch thử chảy vừa đến mặt trờn của lớp bột trong cột, đúng khoỏ.
Dựng 20ml nước để trỏng rửa cốc và giấy lọc rồi chuyển vào cột chiết xuất pha rắn trờn. Tiếp tục mở khoỏ để dung dịch chảy với tốc độ ở trờn. Bỏ dung dịch nước chảy ra. Rửa tiếp với 10ml methanol 30% với tốc độ như trờn.
114
Bỏ cỏc dịch rửa methanol. Rửa giải tiếp với 40ml methanol. Hứng lấy dịch chiết methanol, cụ trờn cỏch thuỷ đến cạn. Dựng methanol để hoà tan và chuyển toàn bộ cắn vào bỡnh định mức 10 ml, thờm methanol vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45àm.
Chỳ ý: Trong quỏ trỡnh chuẩn bị dung dịch thử, khụng được để cột khụ. - Dung dịch chuẩn:
Dung dịch chuẩn ginsenosid Rg1 trong methanol cú nồng độ đó biết khoảng 0,2mg trong 1ml.
Dung dịch chuẩn ginsenosid Rb1 trong methanol cú nồng độ đó biết khoảng 0,2mg trong 1ml.
Dung dịch chuẩn ginsenosid Rd trong methanol cú nồng độ đó biết khoảng 0,2mg trong 1ml.
Tiến hành:
Tiến hành sắc ký theo điều kiện đó nờu, ghi thời gian lưu và diện tớch của cỏc pớc ginsenosid Rg1, ginsenosid Rb1 và ginsenosid Rd trong mỗi dung dịch.
Hàm lượng (g) ginsenosid Rg1 (hoặc ginsenosid Rb1 hoặc ginsenosid Rd) trong 100g chế phẩm được tớnh theo cụng thức:
At ì Cc ì 50 ì 10 ì 100 X(g) =
Ac ì mt(1-b) ì 25 ì 1000 Trong đú:
At và Ac: Diện tớch pớc ginsenosid Rg1 (hoặc Rb1 hoặc Rd) trong dung dịch thử và dung dịch chuẩn.
Cc: Nồng độ dung dịch Rg1 (hoặc Rb1 hoặc Rd) chuẩn (mg/ml). mt: Khối lượng của mẫu thử (g).
b: Độ ẩm của chế phẩm (tớnh theo số thập phõn).
3. ĐểNG GểI, GHI NHÃN, BẢO QUẢN
Đúng gúi trong bao bỡ kớn, trỏnh ẩm. Nhón rừ ràng, đỳng qui cỏch.
115