2.1. Mụ tả: phương phỏp cảm quan.
2.2. Vi phẫu: cắt vi phẫu, nhuộm, soi trờn kớnh hiển vi.
2.3. Soi bột: làm tiờu bản, soi trờn kớnh hiển vi.
2.4. Tro toàn phần: lấy 20 g dược liệu, nghiền nhỏ, sấy tới khối lượng khụng đổi. Lấy 2 g bột khụ tiến hành theo DĐVN III, phụ lục 7.6. khụng đổi. Lấy 2 g bột khụ tiến hành theo DĐVN III, phụ lục 7.6.
2.5. Định tớnh:
106 Cỏch thử:
Nghiền chế phẩm thành bột, lấy 1 g bột dược liệu, cho thờm 5 ml methanol (TT). Đun cỏch thuỷ trong 10 phỳt, để nguội, lọc, được dịch chiết A.
Cho vào ống nghiệm vài giọt dịch chiết A, thờm 3 – 5 ml nước cất. Lắc đếu: bọt cao và bền sau 15 phỳt.
2.5.2. Sõm Ngọc Linh tự nhiờn:
Cỏch thử:
- Dung dịch thử: Nghiền chế phẩm thành bột, lấy 0,5g bột chế phẩm, thờm 30ml cloroform, đun sụi hồi lưu cỏch thủy trong 1 giờ, loại bỏ dịch chiết cloroform. Đuổi hết hơi cloroform ở lớp nước bằng cỏch đun núng nhẹ trờn bếp cỏch thủy, lắc kỹ lớp nước với 30ml n-butanol. Gạn lấy dịch chiết butanol, lắc với 20ml dung dịch amoniac 10%. Gạn lấy lớp butanol, cụ trờn cỏch thuỷ đến cạn. Hoà cắn trong 1ml ethanol tuyệt đối được dung dịch chấm sắc ký.
- Dung dịch đối chiếu: Lấy 0,5g bột SNL, chiết như dung dịch thử. Chấm riờng biệt lờn bản mỏng 10 àl mỗi dung dịch đối chiếu và dung dịch thử thành 2 vạch (mỗi vạch dài khụng quỏ 1cm, rộng khụng quỏ 0,3cm). Tiến hành sắc ký lớp mỏng theo DĐVN III - phụ lục 4,4. Sau khi triển khai được khoảng 12-14 cm, lấy bản mỏng ra, để khụ ở nhiệt độ phũng rồi phun thuốc thử hiện màu, sấy bản mỏng ở 1200C đến khi hiện rừ vết,
Yờu cầu: Dung dịch thử phải cú cỏc vết cựng màu, cựng Rf với cỏc vết của dung dịch đối chiếu.
2.5.3. Ginsenosid Rg1, ginsenosid Rd và ginsenosid Rb1
Trong phần định lượng, sắc ký đồ của dung dịch thử phải cú cỏc pớc cựng thời gian lưu với cỏc pớc Ginsenosid Rg1, Ginsenosid Rb1 và Ginsenosid Rd trong sắc ký đồ của cỏc dung dịch Ginsenosid Rg1, Ginsenosid Rb1 và Ginsenosid Rd chuẩn.
2.6. Định lượng
2.6.1. Saponin
SNL được nghiền nhỏ và sấy khụ tới khối lượng khụng đổi ở 500C. Cõn chớnh xỏc khoảng 0,2 g bột sinh khối sõm khụ cho vào ống ly tõm nhựa 15 ml. Thờm 10 ml methanol, chiết siờu õm (330W, 50 kHz) trong thời gian 1 giờ ở nhiệt độ 25-300C. Ly tõm mẫu ở tốc độ 2500 vũng/phỳt trong 10 phỳt. Lấy phần dịch trong phớa trờn. Cắn tiến hành chiết siờu õm lại 3 lần, như trờn. Gộp
107
cỏc dịch chiết methanol lại bốc hơi cất quay chõn khụng ở nhiệt độ ở < 500C tới khi thu được cắn khụ. Hoà tan cắn trong 5 ml nước rồi chuyển vào cột chiết pha rắn (C18, 500 mg). Rửa lần lượt với 20 ml nước, 10 ml methanol 30%, tốc độ 20 - 25 giọt/phỳt, bỏ cỏc dịch rửa. Rửa giải với 40 ml methanol, dịch rửa giải được cất thu hồi dung mụi trong ỏp suất giảm tới cắn. Sấy tới khối lượng khụng đổi, cõn xỏc định saponin toàn phần.
Hàm lượng saponin toàn phần (%) tớnh theo chế phẩm khụ tuyệt đối: msaponin ì 100
X (%) =
mt Trong đú:
- X (%): Hàm lượng saponin toàn phần (%).
- mt: Khối lượng mẫu SNL tự nhiờn khụ tuyệt đối (g). - msaponin: Khối lượng saponin toàn phần (g).
2.6.2. Ginsenosid Rg1, Rb1 và Rd
* Điều kiện sắc ký:
- Cột Apollo C18 (5àm, 25cm x 4mm ) hoặc cột tương đương - Pha động:
+ Dung mụi A: Hỗn hợp Acetonitril - nước (8:2).
+ Dung mụi B: Nước.
Chương trỡnh pha động (bảng 3.33):
Bảng 3.33. Chương trỡnh pha động định lượng Ginsenosid Rg1, Rb1 và Rd
Thời gian (phỳt) Dung mụi A Dung mụi B
0 --> 25 22 78 25 --> 40 22 --> 35 78 --> 65 40 --> 75 35 --> 42 65 --> 58 75 --> 80 42 --> 100 58 --> 0 80 --> 85 100 --> 22 0 -->78 85 --> 95 22 78
108 - Tốc độ dũng: 2 ml/phỳt.
- Detector UV ở bước súng 203 nm. - Thể tớch tiờm: 10 àl.
* Chuẩn bị dung dịch thử và dung dịch chuẩn:
- Dung dịch thử:
Nghiền nhỏ, sấy khụ bột chế phẩm tới khối lượng khụng đổi. Cõn chớnh xỏc khoảng 0,2 g bột chế phẩm vào bỡnh nún cú nỳt mài 100 ml, thờm chớnh xỏc 50 ml methanol, đậy nỳt, cõn chớnh xỏc khối lượng. Đun sụi hồi lưu cỏch thủy trong 1 giờ, để nguội, cõn xỏc định lại khối lượng, thờm methanol để bổ sung khối lượng mất đi (nếu cần). Ly tõm, hỳt chớnh xỏc 25 ml dịch ly tõm, cụ trờn cỏch thủy đến cạn.
Hũa cắn trong 5ml nước, chuyển vào cột chiết xuất pha rắn (C18, 360 mg đó được hoạt hoỏ lần lượt với 5 ml MeOH, 5 ml MeOH 50%, 5 ml nước). Mở khoỏ, cho dung dịch chảy qua cột với tốc độ 20-25 giọt/phỳt. Khi dung dịch thử chảy vừa đến mặt trờn của lớp bột trong cột, đúng khoỏ.
Dựng 20ml nước để trỏng rửa cốc và giấy lọc rồi chuyển vào cột chiết xuất pha rắn trờn. Tiếp tục mở khoỏ để dung dịch chảy với tốc độ ở trờn, Bỏ dung dịch nước chảy ra. Rửa tiếp với 10ml methanol 30% với tốc độ như trờn. Bỏ cỏc dịch rửa methanol. Rửa giải tiếp với 40ml methanol. Hứng lấy dịch chiết methanol, cụ trờn cỏch thuỷ đến cạn.
Dựng methanol để hoà tan và chuyển toàn bộ cắn vào bỡnh định mức 10 ml, thờm methanol vừa đủ đến vạch, lắc đều. Lọc qua màng lọc 0,45àm.
Trong suốt quỏ trỡnh chuẩn bị dung dịch thử, khụng được để cột khụ. - Dung dịch chuẩn:
Dung dịch chuẩn ginsenosid Rg1 trong methanol cú nồng độ đó biết khoảng 0,2mg trong 1ml.
Dung dịch chuẩn ginsenosid Rb1 trong methanol cú nồng độ đó biết khoảng 0,2mg trong 1ml.
Dung dịch chuẩn ginsenosid Rd trong methanol cú nồng độ đó biết khoảng 0,2mg trong 1ml.
109
* Tiến hành:
Tiến hành sắc ký theo điều kiện đó nờu, ghi thời gian lưu và diện tớch của cỏc pớc ginsenosid Rg1, ginsenosid Rb1 và ginsenosid Rd trong mỗi dung dịch.
Hàm lượng (g) ginsenosid Rg1 (hoặc ginsenosid Rb1 hoặc ginsenosid Rd) trong 100g chế phẩm khụ tuyệt đối được tớnh theo cụng thức:
At ì Cc ì 50 ì 10 ì 100 X (g) =
Ac ì mtì 25 ì 1000 Trong đú:
At và Ac: Diện tớch pớc ginsenosid Rg1 (hoặc Rb1 hoặc Rd) trong dung dịch thử và dung dịch chuẩn.
Cc: Nồng độ dung dịch Rg1 (hoặc Rb1 hoặc Rd) chuẩn (mg/ml). mt: Khối lượng của mẫu thử (g).