d/ Nồng độ oxy hoà tan.
2.2.3. Phương phỏp đỏnh giỏ tớnh an toàn và tỏc dụng sinh học
2.2.3.1. Nghiờn cứu đỏnh giỏ tớnh an toàn
a. Đỏnh giỏ độc tớnh cấp
- Dựa theo phương phỏp nghiờn cứu xỏc định độc tớnh cấp của Abrham W.B., Turner A. và theo quy định của Bộ Y tế Việt nam và Tổ chức Y tế thế giới về nghiờn cứu độc tớnh của thuốc [1], [2], [4], [5].
- Thớ nghiệm được tiến hành trờn chuột nhắt trắng. Chuột được chia làm cỏc lụ, mỗi lụ 12 con. Từng lụ chuột được cho uống dịch chiết tế bào SNL sinh khối với cỏc mức liều tăng dần, đến liều gõy chết 100% số chuột.
- Sau khi uống thuốc, chuột được nuụi dưỡng và theo dừi liờn tục trong 72 giờ. Xỏc định số chuột chết theo từng nhúm thớ nghiệm.
42
- Tớnh toỏn: theo phương phỏp cải tiến của Livschitz P.Z [4].
b.Đỏnh giỏđộc tớnh bỏn trường diễn trờn thực nghiệm
Theo phương phỏp Abraham, quy định của Tổ chức Y tế thế giới và Bộ Y tế về hiệu lực và an toàn thuốc.[1], [3], [4], [5].
* Thiết kế thớ nghiệm:
Thỏ được chia thành 3 lụ, mỗi lụ 8 con.
- Lụ chứng: uống nước muối sinh lý liều 1ml/kgTLCT/24 h.
- Lụ SNL sinh khối mức liều 1: uống SNL sinh khối liều 2g/kgTLCT /24h (1ml/kg/24h dịch chiết 2:1 w/v).
- Lụ SNL sinh khối mức liều 2: uống SNL sinh khối liều 4g/kgTLCT /24h (2ml/kg/24h dịch chiết 2:1 w/v).
* Cỏc chỉ tiờu đỏnh giỏ:
- Sinh lý - dược lý: theo dừi tỡnh trạng chung, hoạt động, ăn uống, đặc biệt là trọng lượng cơ thể, điện tim.
- Huyết học: hồng cầu, hemoglobin, bạch cầu, tiểu cầu - Sinh húa: SGOT, SGPT, creatinin.
- Mụ bệnh học: vào ngày thứ 42, giết thỏ, quan sỏt hỡnh ảnh đại thể gan, lỏch, thận. Sau đú sinh thiết cỏc tạng để nghiờn cứu hỡnh ảnh mụ bệnh học của tất cả cỏc thỏ thực nghiệm.
* Thời điểm xột nghiệm: Tại 3 thời điểm: xuất phỏt điểm, sau 3 tuần, sau 6 tuần dựng SNL sinh khối. Thời gian theo dừi: 6 tuần.
2.2.3.2. Phương phỏp đỏnh giỏ một số tỏc dụng sinh học
a. Đỏnh giỏ tỏc dụng tăng lực của dịch chiết SNL sinh khối.
a-1. Đỏnh giỏ theo mụ hỡnh chuột bơi kiệt sức Brekhman (1951).
* Thiết kế thớ nghiệm:
Chuột nhắt trắng 24 con, chia ngẫu nhiờn thành 3 lụ, mỗi lụ 8 con. - Lụ 1 (SNL sinh khối): uống dịch chiết SNL sinh khối liều 1,2g/kg TLCT.
43
- Lụ 2 (SNL tự nhiờn): uống dịch chiết rễ SNL tự nhiờn, liều 0,24g/kg TLCT.
- Lụ 3 (chứng sinh lý): uống nước cất, liều 0,10ml/10g.
* Cỏc tiến hành:
Cho chuột đã kẹp chì khối lượng bằng 5% trọng lượng cơ thể chuột vào bơi trong bể đường kính 30 cm, chiều cao cột nước 35 – 40 cm; có nhiệt độ ổn định 32oC trong suốt thời gian bơi.
Theo dõi thời gian bơi của chuột từ khi cho vào đến khi chuột kiệt sức (nghĩa là lúc chuột chìm sâu xuống nước, bơi dưới đáy bể trong vài giây mà không ngoi lên mặt nước để thở được). Ghi nhận thời gian bơi lần 1 và lần 2 sau 60 phút ở các lô thử và so sánh thống kê với lô chứng.
* Cỏch đỏnh giỏ:
Tác dụng tăng lực được đánh giá khi % thời gian bơi lần 2/lần 1 của lô thử lớn hơn % bơi lần 2/lần 1 của lô đối chứng.
a-2. Đỏnh giỏ tỏc dụng tăng lực trờn mụ hỡnh Rotarod.
* Thiết kế thớ nghiệm:
Tương tự như mục a-1, mục a, phần 2.2.3.2.
* Cỏch tiến hành và đỏnh giỏ:
Chuột được cặp chì vào đuôi với trọng lượng bằng 5% trọng lượng chuột, sau đó cho chuột bám trên trụ quay, xác định thời gian từ khi đưa chuột lên đến khi chuột bị rơi xuống.
44 Đo ở các thời điểm:
- Trước khi chuột dùng thuốc.
- Sau khi dùng mẫu thử 60 phút (kiểm tra tác dụng sau 60 phút dùng thuốc).
- Sau khi dùng mẫu thử 2 tuần (kiểm tra tác dụng tăng lực sau nhiều ngày dùng thuốc).
So sánh với nhóm chứng.
a-3. Đỏnh giỏ tỏc dụng tăng lực trờn mụ hỡnh do sức cơ chõn chuột
(Grip-strength test).
* Thiết kế thớ nghiệm:
Tương tự như mục a-1, mục a, phần 2.2.3.2.
* Cỏch tiến hành và đỏnh giỏ::
Chuột được uống thuốc 5 ngày, sau đú tiến hành đo sức kộo chõn trước của chuột bằng mỏy đo sức kộo (Ugo Basil, Italia).
Cho chuột bỏm 2 chõn trước vào thanh cầm, cầm đuụi chuột kộo nhẹ nhàng về sau cho tới khi chuột thả chõn bỏm.
Lực kộo tối đa trước khi chuột thả thanh cầm được mỏy ghi lại. Mỗi chuột được thử 3 lần, giữa cỏc lần thử chuột được nghỉ 1phỳt. Lấy giỏ trị trung bỡnh của 3 lần thử.
So sỏnh giữa cỏc lụ.
45
a-4. Ảnh hưởng của SNL tới sự tăng trọng lượng chuột.
Thiết kế thớ nghiệm: Tương tự như mục a-1, mục a, phần 2.2.3.2.
Xỏc định trọng lượng chuột trước và sau khi dựng SNL sinh khối 2 tuần, so sỏnh với nhúm chứng.
b. Nghiên cứu tác dụng trên thần kinh trung −ơng của chế phẩm.
b-1. Đỏnh giỏ ảnh hưởng đến phản xạ cú điều kiện tỡm thức ăn trong
mờ lộ.
* Thiết kế thớ nghiệm: Tương tự như mục a-1, mục a, phần 2.2.3.2.
* Cỏc bước tiến hành thớ nghiệm:
- Tiến hành thành lập phản xạ cú điều kiện trờn chuột nhắt trắng: sau
khi cho chuột uống thuốc 5 ngày. Trong quỏ trỡnh tập cho uống tiếp 5 ngày nữa (tổng thời gian chuột uống thuốc là 10 ngày liờn tục).
+ Cho chuột nhịn ăn qua đờm và tập phản xạ vào cỏc buổi sỏng. Đặt chuột ở cửa vào và dẫn dắt chuột tới đớch, nơi cú thức ăn. Mỗi ngày tập 3 lần, mỗi lần cỏch nhau 5 phỳt. Tập đến khi nào đặt chuột ở cửa vào chuột chạy một mạch tới đớch, khụng quay lại, khụng nhầm vào ngừ cụt, tức phản xạ đó hỡnh thành.
+ Phản xạ tỡm thức ăn trong mờ lộ được xem là bền vững khi cả 3 lần liền nhau thả chuột ở điểm xuất phỏt và mở cửa vào chuột chạy một mạch tới đớch, khụng nhầm đường, khụng quay lại.
- Tiến hành dập tắt phản xạ: sau khi phản xạ đó được bền vững bằng cỏch tiếp tục cho chuột chạy trong mờ lộ, nhưng ở đớch khụng để thức ăn. Khi nào 3 lần liờn tiếp thả chuột ở điểm xuất phỏt chuột khụng chạy tới đớch nữa thỡ xem như phản xạ đó bị dập tắt.
Cỏc chỉ số theo dừi:
- Tốc độ hỡnh thành phản xạ được biểu hiện bằng số lần tập để chuột chạy từ điểm xuất phỏt đến đớch mà khụng nhầm đường.
- Tốc độ cú phản xạ bền vững được tớnh bằng số lần tập để cú 3 lần liờn tiếp chuột chạy từ điểm xuất phỏt đến đớch mà khụng nhầm đường, khụng quay lại.
46
- Tốc độ dập tắt phản xạ được tớnh bằng số lần khụng cho chuột ăn (khụng củng cố) khi chuột tới đớch, đến khi chuột khụng chạy tới nơi để thức ăn nữa.
Hỡnh 2.3. Chuồng mê lộ (classic maze)
b-2. Đỏnh giỏ tỏc dụng cải thiện trớ nhớ trờn chuột nhắt trắng dựng
mụ hỡnh mờ cung nước (Morris water maze)
Đỏnh giỏ tỏc dụng tăng cường trớ nhớ của sinh khối sâm Ngọc Linh bằng mụ hỡnh mờ cung nước (Morris water maze), trờn chuột gõy suy giảm khả năng học tập, ghi nhớ bằng scopolamine.
* Thiết kế thớ nghiệm:
Chuột nhắt trắng 32 con, chia ngẫu nhiờn thành 4 lụ, mỗi lụ 8 con. - Lô 1 (SNL sinh khối): uống dịch chiết SNL sinh khối liều 1,2g/kg TLCT, tiêm phúc mạc scopolamin liều 0,4mg/kg.
- Lô 2 (SNL tự nhiên): uống dịch chiết rễ SNL tự nhiên liều 0,24g/kg TLCT, tiêm phúc mạc scopolamin liều 0,4mg/kg.
- Lô 3 (chứng sinh lý): uống n−ớc cất liều 0,10ml/10g, tiêm phúc mạc n−ớc cất liều 0,10ml/10g.
- Lô 4 (chứng bệnh lý): uống n−ớc cất liều 0,10ml/10g, tiêm phúc mạc scopolamin liều 0,4mg/kg.
Chuột được cho uống 6 ngày trước khi tiến hành thử nghiệm cho bơi, và tiếp tục cho uống thuốc hàng ngày trong suốt quỏ trỡnh thử nghiệm. Vào cỏc ngày thử nghiệm, tiến hành tiờm scopolamin sau khi đó cho chuột uống thuốc 30 phỳt. Sau khi tiờm scopolamin 30 phỳt, tiến hành cho chuột bơi và ghi chộp kết quả.
47
* Cỏch tiến hành thớ nghiệm:
Chuột được cho bơi trong 7 ngày, mỗi ngày 4 lần, mỗi lần tối đa 120s. Thả chuột nhẹ nhàng xuống nước ở một trong 4 vị trớ khởi điểm theo một trỡnh tự ngẫu nhiờn, mỗi vị trớ chỉ dựng một lần trong mỗi ngày. Chuột sẽ cố gắng bơi tỡm đến bục phao nhằm trỏnh nộ hoạt động bơi. Người làm thớ nghiệm luụn ngồi cố định tại 1 vị trớ trong tất cả cỏc buổi thớ nghiệm.
- Ngày 1: Để phao nhụ lờn khỏi mặt nước để huấn luyện chuột. - Ngày 2 đến ngày 5: Để phao chỡm xuống khỏi mặt nước 1cm. - Ngày 6: Rỳt phao ra khỏi bể bơi.
Hỡnh 2.4. Mê cung n−ớc (Morris water maze)
* Cỏch đỏnh giỏ:
- Từ ngày bơi thứ nhất đến ngày thứ 5: Ghi nhận thời gian T kể từ lỳc chuột được thả vào bể bơi đến khi chuột nhảy lờn phao. Chuột được phộp nghỉ trờn phao trong 15s. Nếu sau 120s chuột khụng tỡm thấy phao, người làm thớ nghiệm hướng dẫn chuột bơi đến phao và cho chuột nghỉ trờn phao trong 15s. Trung bỡnh thời gian T của 4 lần bơi từ 4 xuất phỏt điểm trong bể bơi (T1, T2, T3, T4) được gọi là tiềm thời trỏnh nộ được sử dụng để đỏnh giỏ khả năng học tập, nhận thức của chuột.
- Ngày bơi thứ 6: Ghi nhận thời gian chuột bơi trong vựng cú đặt phao. Trung bỡnh thời gian của 4 lần bơi từ 4 xuất phỏt điểm trong bể bơi được gọi là thời gian bơi trong vựng cú bục phao được sử dụng để đỏnh giỏ khả năng ghi nhớ của chuột.
48
b-3. Đỏnh giỏ tỏc dụng lờn hành vi đỏp ứng với mụi trường lạ của
chuột nhắt trắng dựng mụ hỡnh bảng đục lỗ (hole board):
* Thiết kế thớ nghiệm: Tương tự như mục a-1, mục a, phần 2.2.3.2.
* Cỏc bước tiến hành thớ nghiệm:
Cho chuột uống 5 ngày liờn tục trước thử nghiệm, vào một giờ cố định, và cho uống trước khi thử nghiệm 30 phỳt. Thể tớch cho uống như nhau (0,10ml/10g). Chuột được đưa vào phũng thớ nghiệm yờn tĩnh, ỏnh sỏng mờ, ớt nhất 1 giờ trước khi làm thớ nghiệm. Lần lượt đặt từng chuột vào giữa bảng đục lỗ, tiến hành ghi cỏc hành vi của chuột trong 5 phỳt.
Hỡnh 2.5. Bảng đục lỗ Hole Board Cat. No.6650, Ugo Basile
* Cỏc chỉ tiờu theo dừi gồm:
- Số lần chuột thũ đầu xuống lỗ: khi chuột thũ đầu xuống lỗ mà 2 tai chuột ở mức ngang hoặc xuống sõu hơn so với sàn của bảng đục lỗ, mỏy sẽ ghi lại là một lần thũ đầu xuống lỗ, khi chuột đưa đầu lờn và lại thũ xuống, mỏy sẽ đếm tiếp cho lần thũ đầu mới.
- Số lần chuột chuyển sang vị trớ mới (được tớnh khi cả 4 chõn chuột đều đó chuyển sang một vựng khỏc trờn bảng đục lỗ). So sỏnh giữa cỏc lụ.
b-4. Đỏnh giỏ tỏc dụng lờn năng lực thần kinh bằng thử nghiệm
trỏnh nộ chủđộng (active acvoidant):
Đỏnh giỏ tỏc dụng lờn năng lực thần kinh của SNL sinh khối bằng thử nghiệm trỏnh nhộ chủ động (active acvoidant), trờn chuột gõy suy giảm khả năng học tập, ghi nhớ bằng scopolamine.
49
Chuột được cho uống thuốc 6 ngày trước khi bắt đầu tiến hành thử nghiệm, và tiếp tục cho uống thuốc hàng ngày trong suốt quỏ trỡnh thử nghiệm. Vào cỏc ngày thử nghiệm, tiến hành tiờm scopolamine sau khi đó cho chuột uống thuốc 30 phỳt. Sau khi tiờm scopolamin 30 phỳt, tiến hành cho chuột vào thử nghiệm và ghi chộp kết quả.
* Cỏch tiến hành thớ nghiệm:
Chuột được huấn luyện để trỏnh một kớch thớch khụng điều kiện gõy hại, với sự cú mặt của kớch thích cú điều kiện, dùng máy đo phản xạ tự động có điều kiện (automatic reflex conditioner - Ugo Basil, Italia) đặt trong phũng yờn tĩnh. Thiết bị gồm một hộp cú 2 ngăn, thụng qua với nhau bởi một cửa (hỡnh 9). Đặt chuột vào một ngăn, ngăn này được chiếu sỏng trong 30s bởi một ngọn đốn (10W) đặt ở trờn nắp, đõy là một kớch thớch cú điều kiện. Sau 5s kể từ lỳc bật đốn, một kớch thớch khụng điều kiện là sốc điện (0,2mA) liờn tục trong 25s qua lưới ở sàn của hộp. Sau 30s, cả kớch thớch cú điều kiện và kớch thớch khụng điều kiện đều tự động tắt. Một đỏp ứng cú điều kiện được ghi lại khi chuột trỏnh nộ sốc điện bằng cỏch chạy sang ngăn đối diện trong vũng 5s kể từ khi cú kớch thớch ỏnh sỏng. Chuột trỏnh nộ sốc trong khoảng thời gian 25s của sốc điện (bằng cỏch chạy sang ngăn đối diện) được xem là thất bại với trỏnh nộ chống sốc. Mỗi lần kớch thớch ỏnh sỏng và sốc điện như vậy là một thử nghiệm (trial). Khoảng cỏch giữa 2 thử nghiệm liền nhau là 30s.
Chuột được thử 100 thử nghiệm mỗi ngày trong 5 ngày liờn tục. Trước khi thử nghiệm chuột được đặt vào hộp 10 phỳt, cho phộp chỳng thỏm hiểm và làm quen với hộp.
Hỡnh 2.6. Máy đo phản xạ tự động có điều kiện Automatic Reflex
50
* Cỏch đỏnh giỏ:
Số liệu được tớnh bằng số thử nghiệm cú đỏp ứng trỏnh sốc đỳng trong tổng số 100 thử nghiệm. So sỏnh giữa cỏc lụ.
c. Phương phỏp nghiờn cứu tỏc dụng chống oxy húa của chế phẩm.
Việc nghiờn cứu tớnh chất chống oxy húa của SNL sinh khối nhằm tỡm hiểu về tỏc dụng dự phũng và điều trị bệnh, chống lại cỏc tỏc nhõn độc hại từ mụi trường với cơ thể, chống lóo húa… của sinh khối sõm Ngọc Linh.
c-1. Nghiờn cứu ảnh hưởng của SNL sinh khối tới MDA và GSH gan của động vật nghiờn cứu.
* Thiết kế thớ nghiệm:
Chuột thớ nghiệm 32 con chia thành 4 lụ, mỗi lụ 8 con. Lụ 1 (chứng sinh học): uống nước cất + tiờm dầu ăn.
Lụ 2 (chứng gõy độc): uống nước cất + tiờm CCl4 liều 0,5ml/kg TLCT. Lụ 3 (SNL sinh khối): uống dịch chiết SNL sinh khối liều 1,2g/kg/24h
+ tiờm CCl4 liều 0,5ml/kg.
Lụ 4 (SNL tự nhiờn): uống dịch chiết rễ SNL tự nhiờn liều 0,24g/kg/24h + tiờm CCl4 liều 0,5ml/kg.
* Cỏch tiến hành và đỏnh giỏ:
Tiến hành cho uống bằng kim cong đầu tự với thể tớch cho uống ở tất cả cỏc lụ như nhau 0,1ml/10g TLCT, cho uống hàng ngày vào một giờ cố định (8 giờ sỏng), trong 6 ngày liờn tục. Chiều ngày thứ 6 tiến hành gõy độc bằng CCl4 tiờm bắp liều 0,5ml/kg (tớnh theo thể tớch CCl4 nguyờn chất) cho lụ 2, lụ 3 và lụ 4. Lụ 1 tiờm bắp dầu ăn. Thể tớch tiờm ở tất cả cỏc lụ là 0,1ml/10g TLCT. CCl4 được pha loóng bằng dầu ăn với tỷ lệ thớch hợp để được thể tớch tiờm cũng như liều CCl4 nguyờn chất như đó nờu trờn. Sau gõy độc 16 giờ, tiến hành giết chuột theo phương phỏp kộo gión đốt sống cổ, mổ nhanh lấy gan, rửa sạch bằng nước muối sinh lý lạnh, và nhanh chúng tiến hành xỏc định cỏc chỉ tiờu MDA/gan và GSH/gan theo cỏc phương phỏp đó nờu.
c-2. ảnh h−ởng của SNL sinh khối đến cỏc chỉ số GSH, SOD, GPx trong mỏu của động vật thực nghiệm.
* Thiết kế thớ nghiệm:
51
* Cỏch tiến hành và đỏnh giỏ:
Tiến hành cho uống bằng kim cong đầu tự với thể tớch cho uống ở tất cả cỏc lụ như nhau 0,1ml/10g TLCT, cho uống hàng ngày vào một giờ cố định (8 giờ sỏng), trong 6 ngày liờn tục. Chiều ngày thứ 6 tiến hành gõy độc bằng CCl4 tiờm bắp liều 0,5ml/kg (tớnh theo thể tớch CCl4 nguyờn chất) cho lụ 2, lụ 3 và lụ 4. Lụ 1 tiờm bắp dầu ăn. Thể tớch tiờm ở tất cả cỏc lụ là 0,1ml/10g TLCT. CCl4 được pha loóng bằng dầu ăn với tỷ lệ thớch hợp để được thể tớch tiờm cũng như liều CCl4 nguyờn chất như đó nờu trờn. Sau gõy độc 16 giờ, tiến hành giết chuột theo phương phỏp cắt đầu, lấy mỏu xỏc định cỏc chỉ tiờu GSH/mỏu, SOD/mỏu, GPx/mỏu, TAS /mỏu.