2. Mục tiêu của đề tài
3.2.2.3Phƣơng pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiệm
a, Đối với mẫu cỏ
Mẫu thực vật thu đƣợc đem về đƣợc xác định tên cây theo tài liệu của Phạm Hoàng Hộ, (1993), M.Schmid, (1958), (18).
- Mang mẫu đi phân tích ngay.
* Nghiên Cứu năng suất: Theo phƣơng pháp của Hoàng Chung (2006), mang mẫu cỏ ngoài tự nhiên về phòng thí nghiệm, mẫu cỏ này đƣợc phân thành hai phần: Phần tƣơi và phần chết. phần tƣơi đƣợc chia theo các
nhóm, sau đó cân và sấy khô. Phần khô và phần chƣa hoàn toàn mục nằm trên mặt đất thuộc phần chết chung.
Với mẫu cỏ Mật trồng làm tƣơng tự nhƣ mẫu cỏ ngoài tự nhiên. Mẫu cỏ Lau trồng đƣợc phân thành phần thân và phần lá, sau đó mang đi cân và sấy khô.
* Đánh giá chất lƣợng của cỏ
Phƣơng pháp lấy mẫu: Tiến hành lấy mẫu ở hai ô thí nghiệm và mẫu cỏ ngoài tự nhiên. Mẫu đƣợc ghi chép đầy đủ các thông tin nhƣ: Họ và tên ngƣời lấy mẫu, tên mẫu, ngày lấy mẫu và địa điểm lấy mẫu.
Phân tích các mẫu với các chỉ tiêu nhƣ sau: Hàm lƣợng nƣớc, vật chất khô, hàm lƣợng protein, đƣờng, xơ tổng số, lipit. Các mẫu đƣợc phân tích tại Viện Khoa học Sự sống - Đại học Thái Nguyên.
* Phƣơng pháp xác định vật chất khô trong cỏ.
Việc xác định độ ẩm của thức ăn gia súc đƣợc tiến hành theo tiêu chuẩn Việt nam (TCVN) - 4326-86.
+ Nguyên lý
Sấy mẫu khô tuyệt đối ở nhiệt độ 1050C cho tới khi có khối lƣợng không đổi và xác định sự thay đổi trong quá trình sấy.
+ Thiết bị
Cân phân tích với độ chính xác đến ± 0,0001 gam. Tủ sấy điều chỉnh đƣợc nhiệt độ ± 10C.
Hộp nhôm + nắp có đƣờng kính 65mm, cao 30mm. Bình hút ẩm có chứa chất hút ẩm.
+ Các bƣớc tiến hành
Sấy hộp nhôm và nắp ở nhiệt độ 1050C trong vòng 30 phút sau đó để nguội trong bình hút ẩm cân chính xác đến 0,0001g.
Cân vào hộp nhôm 5 gam mẫu ở trạng thái khô không khí với độ chính xác 0,0001 gam. Mở nắp hộp nhôm, đặt nắp xuống đáy của hộp sau đó cho vào tủ sấy, sấy ở nhiệt độ 1050C (± 10C) trong vòng 4 giờ tính từ khi nhiệt độ của tủ sấy đạt nhiệt độ 1050C (chú ý thời gian để tủ sấy đạt nhiệt độ 1050C tính từ lúc bắt đầu cho hộp vào sấy không đƣợc vƣợt quá 30 phút). Sau khi sấy 4 giờ, chúng ta đậy nắp hộp nhôm lại sau đó lấy ra cho vào bình hút ẩm. Chờ mẫu nguội thì đem cân.
Khối lƣợng mẫu giảm khi sấy đƣợc coi là lƣợng nƣớc, phần còn lại sau khi sấy kiệt gọi là lƣợng vật chất khô.
+ Tính toán kết quả
Lƣợng vật chất khô trong mẫu phân tích (S) đƣợc tính bằng công thức (%): S = m1/m × 100
Trong đó: S: Lƣợng vật chất khô trong mẫu (%)
m1: Khối lƣợng mẫu sau khi sấy ở 1050C m: Khối lƣợng mẫu trƣớc khi sấy ở 1050C.
* Xác định hàm lƣợng nƣớc trong cỏ
Hàm lƣợng nƣớc = 100% - vật chất khô (%)
* Phƣơng pháp phân tích hàm lƣợng chất xơ theo Heenerbeg -
Stohmann:
Chất xơ đƣợc coi là tổng hợp của nhiều chất nhƣ Xenluloze, hemixenluloze, các chất pectin, lignin. Việc định nghĩa chất xơ không dễ dàng, mà thƣờng đƣợc coi là các chất còn lại sau quá trình thuỷ phân.
Chất xơ thô là phần còn lại của các nguyên liệu có nguồn gốc thực vật sau quá trình thuỷ phân bằng Axit sunfuric và dung dịch Natrihidroxit.
Chất xơ thực phẩm là phần còn lại của các tế bào thực vật đƣợc phân huỷ bằng các men tiết ra từ các tuyến tiêu hoá. Đó là hỗn hợp Xenluloze, (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Việc phân tích chất xơ là một phƣơng pháp cổ điển nhƣng luôn luôn là vấn đề cần đƣợc thảo luận thấu đáo. Do quá trình thuỷ phân hoá học các chất trong mẫu phân tích luôn luôn cần một môi trƣờng càng chính xác bao nhiêu càng cho kết quả chính xác bấy nhiêu.
Từ quan điểm trên, việc phân tích chất xơ có thể đƣợc tiến hành theo hai cách: Phƣơng pháp hoá học và phƣơng pháp sử dụng enzim. Trong đó, phƣơng pháp phân tích hoá học dùng để phân tích chất xơ là một trong những phƣơng pháp cổ điển nhất của phƣơng pháp phân tích thành phần hoá học có trong thức ăn. Bản chất của phƣơng pháp này xuất phát từ quá trình thuỷ phân các chất của tế bào thực vật.
+ Hoá chất:
Dung dịch Axit sunfuric (H2SO4) 0.255 ± 0.005N. Dung dịch Natrihidroxit (NaOH) 0.313 ± 0.005N. Acetone.
+ Thiết bị:
Thiết bị phân tích xơ ANKOM 200/220.
Túi lọc: Sử dụng túi lọc ANKOM F57 hoặc F58.
Dụng cụ hàn miệng túi: Yêu cầu có nhiệt độ cao đủ để làm chảy nhựa polime trong túi lọc (số hiệu # 1915 hoặc 1920).
Tủ sấy
+ Các bƣớc tiến hành:
Đánh dấu túi lọc bằng bút không bị xoá trong dung môi. Cân túi lọc
(ghi w1.1) sau đó chỉnh cân về không (ấn phím TARE).
Túi đối chứng: Cân ít nhất 1 túi không và cho vào cùng phân tích (ghi w1.2), điều này cho phép xác định sai số xảy ra đối với độ ẩm và khối lƣợng của túi.
Cân khoảng 1g mẫu cho thẳng vào túi lọc (ghi w2). Mẫu cân phải cho sát đáy túi.
Hàn miệng túi trong khoảng 4 mm tính từ miệng túi bằng dụng cụ hàn túi. Dàn đều mẫu trong túi vào khay chứa túi của máy ANKOM. Sử dụng tất cả chín khay mà không quan tâm đến số túi phân tích. Đặt cả trục chứa các khay mẫu vào buồng phân tích, đặt khối sắt trụ trên khay thứ 9 không chứa mẫu để dìm toàn bộ khay xuống.
+ Khi phân tích 24 túi lọc, đổ vào đó 1.900 - 2.000 ml dung dịch axit có nhiệt độ ổn định cho đến khi ngập túi lọc. Nếu phân tích ít hơn 20 túi, cho theo tỉ lệ 100ml axit/1 túi (tối thiểu phải có 1.500ml).
+ Công phá 40 phút bằng dung dịch axit sunfuric (H2SO4) 0.255 ± 0.005N, sau đó rửa nƣớc cất 2 lần (mỗi lần 5 phút).
+ Công phá 40 phút bằng dung dịch Natrihidroxit (NaOH) 0.131 ± 0.005N, sau đó rửa bằng nƣớc cất 3 lần.
+ Tháo túi lọc khỏi khay, bóp nhẹ cho bớt nƣớc thừa. Cho túi vào cốc thuỷ tinh có thể tích 250 ml, cho thêm acetone.
+ Trải đều túi lọc để khô không khí. Cho vào tủ sấy đặt nhiệt độ 1050C, sấy trong vòng 2 - 4 giờ.
(Chú ý: Không cho túi lọc vào tủ sấy trƣớc khi acetone khô hết).
+ Sau khi sấy khô, lấy túi lọc ra cho vào bình hút ẩm. Để nguội và cân (ghi w3). Tính lƣợng xơ và khoáng của mẫu bằng công thức w4:
w4= w3- w1.1
+ Đƣa cả túi đối chứng và túi chứa mẫu vào đốt trong lò nung ở nhiệt độ 5500
C trong vòng 2 giờ, để nguội trong bình hút ẩm và cân (ghi w5.1: Là khối lƣợng chén + khoáng của mẫu, w5.2: Là khối lƣợng chén + bao đối chứng sau khi đốt).
Tính lƣợng khoáng thực sự của mẫu nhƣ sau: W5 = (w5.1- wCM) - (w5.2 -wCĐC)
- Tính toán kết quả:
Hàm lƣợng xơ thô tính bằng % theo công thức sau: X = W4 - W5/W2 × 100
Trong đó:
X: Hàm lƣợng xơ thô (%). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
W2: Khối lƣợng mẫu phân tích tính bằng gam.
W4: Khối lƣợng chất xơ và khoáng sau khi lọc ete, axit, bazơ và acetone.
W5: Khối lƣợng tro của chất xơ sau khi nung.
* Phân tích hàm lƣợng protein theo phƣơng pháp MicroKjeldan.
- Nguyên lý:
Trong phƣơng pháp MicroKjeldan ngƣời ta vô cơ hoá mẫu bằng H2SO4
98% kết hợp với chất xúc tác để chuyển nitơ hữu cơ thành dạng (NH4)2SO4, rồi dùng NaOH để đẩy NH3 ra khỏi muối Amoni, sau khi đƣợc giải phóng ra sẽ đƣợc cuốn đi bằng dòng hơi nƣớc nóng. Sau khi đƣợc làm nguội sẽ đƣợc hấp thụ vào dung dịch H3BO3 ở trong bình hứng tạo ra muối borat amon có màu xanh trong.
(NH4)2SO4 + 2NaOH = 2NH3 + Na2SO4 + 2H2O 3NH3 + H3BO3 = (NH4)3BO3
Để xác định đƣợc lƣợng amoniac giải phóng ra trong quá trình chƣng cất ta đem đi chuẩn độ bằng dung dịch H2SO4 0.1N đến khi nào dung dịch chuyển sang màu tím nhạt là đƣợc.
2(NH4)3BO3 + 3H2SO4 = 3(NH4)2SO4 + 2H3BO3
Từ lƣợng axit H2SO4 0.1N tiêu tốn trong quá trình chuẩn độ chúng ta tính đƣợc lƣợng nitơ có trong mẫu.
- Dụng cụ:
- Hoá chất:
H2SO4 đậm đặc 98%; Viên xúc tác Kjeldahl (Hỗn hợp Cu và Se); H2SO4 0.1N; NaOH 33%; H3BO3 4% cùng với chất chỉ thị mầu Tashio (gồm hỗn hợp màu xanh Methylen và đỏ Methylen); Nƣớc cất.
- Cách tiến hành:
Giai đoạn công phá mẫu:
+ Bƣớc 1: Cân mẫu:
Mẫu đƣợc xấy khô ở nhiệt độ 50 - 600C, sau đó nghiền nhỏ.
Tiến hành: Cân chính xác và cẩn thận bằng cân phân tích (có độ chính xác 0.0001g) từ 1 - 1,5g mẫu cho vào bình công phá (trƣớc khi cho mẫu đã cân vào ống thì ta phải cho vào ống 1 viên xúc tác trƣớc), sau đó cho vào 10ml H2SO4 đậm đặc 98%, bịt chặt ống đốt mẫu bằng giấy thiếc và ngâm qua đêm.
Chú ý: Để tăng độ chính xác khi phân tích, chúng ta phải bố trí một ống Kjeldahl đối chứng chỉ có chất xúc tác H2SO4 đậm dặc mà không có mẫu phân tích, tiến hành tất cả các mẫu nhƣ mẫu phân tích thật.
+ Bƣớc 2: Công phá mẫu:
Nhiệt độ cần cho quá trình công phá là 3800C, thời gian công phá là 40 phút. Khi quá trình công phá đã đƣợc, ta đợi nhiệt độ của ống kjeldahl hạ xuống bằng nhiệt độ môi trƣờng rồi đƣa vào trƣng cất.
Giai đoạn trƣng cất và phân tách amoniac sau khi công phá:
Sau khi công phá xong ta tiến hành trƣng cất trên máy cất đạm tự động Garhardt. Máy tự động hút dung dịch NaOH, H3BO3 và nƣớc cất. Thời gian trƣng cất là 5 phút (chú ý khi chạy máy phải đủ lƣợng nƣớc làm lạnh), dung dịch sau trƣng cất có màu xanh.
Giai đoạn xác định lƣợng amoniac giải phóng ra sau quá trình trƣng cất: Để xác định đƣợc lƣợng amoniac giải phóng ra trong quá trình trƣng cất
chuyển sang màu tím nhạt là đƣợc, từ lƣợng axit H2SO4 tiêu tốn trong quá trình chuẩn độ chúng ta tính đƣợc lƣợng đạm có trong mẫu.
- Tính kết quả: Dựa trên lƣợng axit Sunfuric 0.1N tính ra hàm lƣợng protein có trong mẫu.
* Xác định hàm lượng đường khử theo phương pháp bertrand;
- Nguyên tắc:
Đƣờng khử do trong cấu trúc có nhóm aldehit có tính khử mạnh nên có khả năng tham gia phản ứng tráng bạc và phản ứng với dung dịch dehling. R-CHO - 2AgNO3 + 3NH3 + H2O → R-COONH4 + 2NH4NO3 + 2Ag↓ R-CHO - 2Cu(OH)2 → R-COOH + Cu2O↓ + 2H2O (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
10FeSO4 + 2KmnO4 +8H2SO4 → K2SO4 + 2MnSO4 +5Fe2(SO4)3 + 8H2O
Khi dùng dung dịch chuẩn KMnO4 0.1N để chuẩn độ lƣợng Fe2(SO4)3 tạo thành.
* Xác định hàm lượng lipit tổng số theo phương pháp Soxhlet
b, Đối với mẫu đất
Tại mỗi điểm nghiên cứu: Gồm cả bãi cỏ tự nhiên và bãi cỏ trồng, chúng tôi lấy mẫu đất tại các vị trí khác nhau sao cho nó phản ánh đƣợc môi trƣờng đặc trƣng cùng với vị trí tƣơng ứng các mẫu cỏ. Mẫu đất đƣợc lấy ở độ sâu: 0 - 20cm (độ sâu bám rễ chủ yếu của cỏ), trộn lẫn lộn, sau đó đem phân tích tại Viện Khoa học Sự sống - Đại học Thái Nguyên. Mẫu đất sau khi lấy về đƣợc cân tƣơi, sau đó cũng xử lí khô không khí nhƣ mẫu cỏ.
* Xác định độ pH
Cân 5 gam đất đã qua rây 1mm cho vào 25ml KCl 1N lắc 10 phút rồi ngâm qua đêm, sau đó lắc và đo trên máy Metter, đọc trị số pH trên máy.
Cân 0,1 gam đất đã qua rây 0,25mm cho vào bình tam giác 100ml + 10 ml dung dịch K2Cr2O7 (0,4N) lắc nhẹ, cắm phễu con trên miệng bình để ngƣng lạnh, rồi đặt bình trong nồi parafin, đun sôi dung dịch trong 5 phút ở nhiệt độ 1700C - 1800C cho đến khi dung dịch không có màu xanh. Để nguội rồi đổ vào bình tam giác nƣớc cất, tráng phễu và ống nghiệm cũng đổ vào bình tam giác, thêm 1ml H3PO4 và 8 giọt chỉ thị màu Fenylantranyn, sau đó dùng dung dịch muối Mo chuẩn độ lƣợng Kalibicromat thừa đến lúc dung dịch biến đổi màu sang màu xanh, tính kết quả.
* Xác định hàm lượng đạm tổng số (N%) theo phương pháp Kjeldahl mô tả ở trên.
* Xác định hàm lượng lân tổng số (P2O5%)
Hút 5ml dung tích mẫu sau khi công phá, chỉnh đến pH = 7 bằng dung dịch NaOH 10%, sau đó thêm 10ml H2SO4 5N, thêm 1,25ml dung dịch axit Ascobic 1M. Đun cách thuỷ trên bếp đến khi cƣờng độ màu lớn nhất, để nguội ở nhiệt độ phòng, định mức đến 50ml đem so màu trên máy DELL/2000, số đọc là % P2O5.
Nguyên tắc của phƣơng pháp là thu bức xạ nguyên tử Kali phát ra dƣới tác dụng kích thích của ngọn lửa hồ quang. Khi bức xạ này đi qua máy quang phổ nhiễu xạ thu đƣợc phổ bức xạ. Cƣờng độ vạch phổ tỉ lệ với nồng độ nguyên tố Kali trong mẫu. Đo cƣờng độ vạch phổ ta tính đƣợc nồng độ nguyên tố, phép đo thực hiện trên máy quang phổ loại DES 8-3; độ nhạy vạch K là 0,01%.