- Chủng vi khuẩn TD02 và TD04 Xạ khuẩn XK07 và XK26 được phân
3.2.1.1. Nghiên cứu đặc điểm hình thái [7]
a, Vi khuẩn
- Đặc điểm hình thái của vi khuẩn được quan sát dưới kính hiển vi điện tử và được chụp tại Khoa Hình thái, Viện 69 thuộc Bộ Tư lệnh Lăng Chủ tịch Hồ Chí Minh.
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp………………….. 42 + Xác định khả năng phân giải gelatin: đổ môi trường vào ống nghiệm, khử trùng ở 1atn trong 30 phút, để nguộị Cấy vi khuẩn và nuôi ở 45 oC. Sau khi vi khuẩn đã phát triển mạnh, để ở tủ lạnh 4 oC trong 4 giờ rồi quan sát khả năng phân giải gelatin.
+ Xác định khả năng thủy phân tinh bột:
Môi trường tinh bột được khử trùng ở 0,8 atm trong 20 phút, sau đó đổ ra đĩa petrị Cấy chấm điểm vi khuẩn vào các đĩa, nuôi trong tủ 37 oC trong 48 h. Sau đó lấy ra thử thuốc thử Lugol. Nếu vi khuẩn có khả năng thủy phân tinh bột chúng sẽ tạo vòng phân giải xung quanh chỗ vi khuẩn sinh trưởng [7].
b, Xạ khuẩn [55]
Đặc điểm hình thái: Quan sát hình thái cuống sinh bào tử: xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường Gauze 1 và ISP4 có cắm lam kính nghiêng trên mặt môi trường. Sau khi xạ khuẩn phát triển tốt, trên lam kính có xạ khuẩn, lấy ra để quan sát dưới kính hiển vi quang học. Cuống sinh bào tử có dạng: R – thẳng; RF – lượn sóng; RA – hình móc câu hay xoắn khơng hồn toàn và S – xoắn.
+ Cấu tạo của bề mặt bào tử được quan sát và chụp ảnh dưới kính hiển vi điện tử. Bề mặt bào tử xạ khuẩn có dạng : Sm – nhẵn; Wa – xù xì, mụn tóc; Sp – dạng gai và Ha – dạng tóc.
Đặc điểm ni cấy:
+ Quan sát màu sắc khuẩn ty khí sinh, khuẩn ty cơ chất và sắc tố tan: Các chủng xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường Gauze 1, Gauze 2, ISP2, ISP4 ở nhiệt độ thích hợp, kéo dài 7, 14 và 21 ngàỵ Quan sát màu khuẩn ty khí sinh, khuẩn ty cơ chất và sắc tố tiết ra môi trường theo phương pháp của Sherling và Gottlieb trên bảng màu của Tresner và Barkus.
+ Khả năng hình thành melanin: xạ khuẩn được ni trên mơi trường ISP6 ở nhiệt độ thích hợp. Quan sát sự thay đổi màu của môi trường từ ngày
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp………………….. 43 thứ 2 đến ngày thứ 14. Nếu sinh melanin, màu của môi trường sẽ chuyển từ màu vàng nhạt sang màu nâu đậm và màu đen.
Đặc điểm sinh lý, sinh hóa:
+ Khả năng phân giải gelatin: phương pháp tương tự như vi khuẩn + Khả năng thủy phân tinh bột: môi trường Gause1 được khử trùng ở 1atm trong 30 phút, đổ đĩa Petri, cấy xạ khuẩn và nuôi ở 45 oC, sau khi xạ khuẩn phát triển mạnh thì thử bằng thuốc thử Lugol, xác định vịng phân giải tinh bột.
* Phương pháp nhuộm Gram vi khuẩn [7]: Chủng nghiên cứu được nhuộm Gram theo trình tự như sau:
Dùng que cấy lấy sinh khối chủng được nuôi cấy qua đêm và dàn đều trên lam kính có chứa một giọt nước cất đã khử trùng sao cho tạo thành một lớp mỏng. Sau khi mẫu đã khô, hơ nhanh trên ngọn lửa đèn cồn để cố định mẫu (1 ÷ 3 giây). Nhỏ dung dịch tím kết tinh trong khoảng thời gian 1 phút. Rửa nhẹ mẫu và để khô rồi tiếp tục nhỏ lugol và giữ trong khoảng 1 phút. Sau bước này, mẫu nhuộm được rửa nhanh bằng cồn 95 % trong 6 giâỵ Mẫu tiếp tục được nhuộm với safranin trong 30 giây (có thể nhuộm bằng fucsin) và rửa nhẹ rồi để khô. Sau khi nhuộm mẫu được quan sát bằng kính hiển vi quang học dưới vật kính dầu có độ phóng đại 100X. Nếu tế bào Gram dương sẽ bắt màu tím đậm cịn nếu tế bào là Gram âm sẽ bắt màu hồng hoặc màu đỏ.
* Đếm số lượng số vi khuẩn và xạ khuẩn theo phương pháp pha loãng tới hạn [7]:
Cân 1g mẫu cho vào 9ml nước muối sinh lý vô trùng và lắc đềụ Sử dụng nước vơ trùng pha lỗng mẫu thành 10-2 bằng cách hút 1 ml ở dung dịch ban đầu sang 9 ml nước vơ trùng. Tiếp theo pha lỗng đến 10-3 bằng cách hút 1 ml nước ở dung dịch 10-2 sang 9 ml nước vô trùng … tương tự như vậy đối với các nồng độ khác, ta pha loãng đến 10-10.
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp………………….. 44 Dùng pipet vô trùng lấy 0,1 ml dịch đã pha loãng cho vào từng hộp Petri với những mơi trường thích hợp. Dùng que gạt vô trùng gạt đều dịch mẫu trên bề mặt thạch, đợi khô bề mặt thạch, úp ngược đĩa petri, nuôi trong tủ ấm với nhiệt độ và thời gian thích hợp. Đếm số lượng khuẩn lạc trên mỗi đĩăthường xác định mật độ vi sinh vật ở nồng độ 106, 107)
Mật độ vi sinh vật trên một đơn vị kiểm tra (ml) được tính theo cơng thức sau: 1 ( 1) 1 2 ( .10 ... .10 n ). n C N n n − n − − m = + + + ∑
Với N: số lượng tế bào/ml
∑C: tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa petri n1: số khuẩn lạc trong đĩa petri ở tỷ lệ pha loãng lần 1 n2: số khuẩn lạc trong đĩa petri ở tỷ lệ pha loãng lần 2 nn: số khuẩn lạc trong đĩa petri ở tỷ lệ pha loãng lần n m: thể tích dịch cho vào (ml)