- Chủng vi khuẩn TD02 và TD04 Xạ khuẩn XK07 và XK26 được phân
3.2.1.3.Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng của vi khuẩn và xạ khuẩn
và xạ khuẩn
+ Ảnh hưởng của nhiệt độ
Để nghiên cứu sự sinh trưởng của các chủng vi khuẩn ở các nhiệt độ khác nhau, sử dụng môi trường MPA dịch thể. Sau đó, cấy các chủng vi
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp………………….. 45 khuẩn trong các ống nghiệm chứa môi trường đã vô trùng và để ở các thang nhiệt độ: 25; 35; 45; 55; 65 và 75 oC. Sau 48 giờ nuôi cấy, xác định khả năng sinh trưởng (OD620 nm) [7]. Cấy các chủng xạ khuẩn trong các ống nghiệm chứa môi trường Gause1 đã vô trùng và nuôi ở các thang nhiệt độ: 25; 35; 45; 55; 65 và 75 oC. Sau 3 ÷ 5 ngày, xác định khả năng sinh trưởng bằng cách cân sinh khối tươi .
+ Ảnh hưởng của pH
Sử dụng mơi trường MPA có pH ban đầu là: 6; 6,5; 7; 7,5; 8 và 8,5. Cấy vi khuẩn, nuôi ở 45oC, sau 48 giờ xác định khả năng sinh trưởng bằng cách đo OD620 nm. Cấy các chủng xạ khuẩn vào mơi trường Gause1 có pH từ 6 ÷ 8,5, ni ở 45 oC trong 72 giờ, đánh giá khả năng sinh trưởng bằng cách cân sinh khối tươi [7].
+ Ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến khả năng sinh trưởng
Nuôi cấy vi khuẩn vào mơi trường MPA pH 7 sau đó bổ sung NaCl với các nồng độ khác nhau lần lượt là (g/l): 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, và 8, nuôi ở 45 oC trong 48h. Đánh giá sinh trưởng bằng chỉ số OD620nm. Với các nồng độ muối được bổ sung như trên vào môi trường Gause1 pH 7, tiến hành nuôi cấy xạ khuẩn ở 45 oC sau 72 giờ đánh giá khả năng sinh trưởng bằng cách cân sinh khối tươị
+ Phân loại vi khuẩn theo kit chuẩn API 50 CHB
Các đặc điểm phân loại được thực hiện dựa trên khả năng lên men 49 loại đường. Lấy 1 ÷ 4 khuẩn lạc (ni cấy trong 24 giờ) làm đồng nhất trong mơi trường API 50CHB. Sau đó dùng pipet hút dịch huyền phù nhỏ vào từng tube, không cho vào nắp. Nhỏ parafin lên miệng tube nhằm giữ cho dịch môi trường không bị tràn và tránh bị lây nhiễm. Nuôi cấy được thực hiện ở 37 oC rồi đọc kết quả sau 24 giờ và 48 giờ. Trong suốt quá trình ni cấy, các đường lên men tạo thành axit làm giảm pH, được nhận biết bằng sự đổi màu chất chỉ thị.
Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nơng nghiệp………………….. 46
+ Phương pháp đánh giá tính đối kháng giữa các chủng vi sinh vật
Đối kháng giữa các chủng vi khuẩn: Cấy vi khuẩn sao cho các đường cấy giao nhau trên môi trường MPA, nuôi ở 45 oC sau 48 giờ quan sát sinh trường của các chủng ở các đường giao nhaụ
Đối kháng giữa các chủng xạ khuẩn: Cấy xạ khuẩn sao cho các đường cấy giao nhau trên môi trường Gause1, nuôi ở 45 oC trong 3 ÷ 5 ngày rồi quan sát sinh trưởng.
Đối kháng giữa các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn: Môi trường MPA được bổ sung vi khuẩn lúc thạch ở nhiệt độ 40 ÷ 45 oC rồi đổ đĩa petri, sau đó dùng các mảnh giấy lọc trịn đường kính 3 ÷ 5 mm thấm dịch đã nuôi xạ khuẩn sau một thời gian, đặt các mảnh giấy này lên trên mặt thạch đã bổ sung vi khuẩn rồi để vào tủ 4 oC khoảng 6 ÷ 8 giờ để dịch khuếch tán ra thạch. Nuôi ở tủ 45 oC, sau 48 giờ quan sát sự sinh trưởng của vi khuẩn xung quanh các mảnh giấy thấm [7].