1.3. CHẾ PHẨM CHIẾT XUẤT THU NHẬN TỪ CÂY THUỐC
1.3.4. Chiết xuất quercetin từ cây thuốc
Quercetin đã đƣợc phát hiện đầu tiên ở dạng aglycon của quercetrin có trong vỏ cây Querceus tinctorial [17, 55, 92]. Cho đến nay, các công trình nghiên cứu mới về quercetin trong lĩnh vực chiết xuất và nghiên cứu hoạt tính in vivo, in vitro vẫn tiếp tục đƣợc thực hiện, nh m gia tăng những hiểu biết về hoạt tính sinh học cũng nhƣ giá trị
30
ứng dụng của quercetin trong chăm sóc sức khỏe cho con người [166].
Quercetin đƣợc xác định có phổ biến trong thực vật, là ch dấu hóa học cho cao chiết hoặc bài thuốc cổ truyền [17]. Chiết xuất chế phẩm quercetin đƣợc thực hiện trên cơ sở áp dụng những nguyên lý chung về chiết xuất hợp chất thứ cấp thứ từ cây thuốc và những đặc trƣng riêng, liên quan đến tính chất hóa lý và sinh học đặc thù của quercetin. Quercetin là hợp chất thứ cấp có hoạt tính chống oxy hóa mạnh, tồn tại phổ biến trong các cây thuốc ở dang tự do hoặc kết hợp với các phân tử đường. Chế phẩm chứa quercetin với mức độ tinh khiết khác nhau đã đƣợc nghiên cứu, thu nhận từ cây thuốc theo các điều kiện chiết xuất không giống nhau để nghiên cứu hàm lƣợng, hoạt tính sinh học hoặc làm nguyên liệu ứng dụng trong lĩnh vực y dƣợc. Khi đó, quy trình thu nhận chế phẩm quercetin có thể được tiến hành theo nhiều phương pháp với các kĩ thuật chiết xuất, hệ dung môi và đối tƣợng chiết xuất khác nhau, tùy thuộc vào mục đích thu nhận [21, 142].
1.3.4.1. Chiết xuất quercetin từ cây thuốc cho mục đích xác định hàm lượng bằng phương pháp HPLC
Hàm lƣợng trong nguyên liệu từ cây thuốc là dữ liệu quan trọng để đánh giá hiệu suất thu nhận quercetin theo các điều kiện chiết xuất khác nhau cũng nhƣ trong nghiên cứu về dịch tễ [51]. Quá trình phân tích hàm lƣợng quercetin từ cây thuốc gồm tách, nhận dạng và đo lường [30]. Khi đó, phương pháp có độ chính xác, nhanh chóng là sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC , thường được sử dụng để xác định hàm lượng quercetin trong cây thuốc [30]. Khi phân tích b ng HPLC, thu nhận dịch chiết xuất chứa quercetin từ nguyên liệu cây thuốc là bước quan trọng và được thực hiện theo hai pha rắn và lỏng. Trong đó, pha lỏng là hệ dung môi và pha rắn là bột nguyên liệu từ cây thuốc [29, 51].
Các hệ dung môi khác nhau đƣợc thiết lập tùy thuộc vào dạng tồn tại của quercetin trong cây thuốc [31]. Theo báo cáo của Dmitrienko và cộng sự (2012), trích ly quercetin hiệu quả nhất khi sử dụng dung môi tách là methanol, ethanol ở dạng nguyên chất không pha loãng hoặc hỗn hợp dạng pha loãng với H2O. Nồng độ dao động khoảng 50% đến 80% [51]. Trong các kĩ thuật chiết xuất đun hồi lưu hoặc siêu âm, dung môi ethanol/H2O, methanol/H2O có hoặc không có axit thường được sử dụng [110, 171]. Theo hệ dung môi, quercetin đƣợc chiết xuất từ cây thuốc chủ yếu theo
31 một trong ba cách sau:
(1) trích ly trực tiếp từ bột cây thuốc thu dịch chiết toàn phần, trong hệ dung môi không có axit (ethanol/H2O hoặc methanol/H2O [170]. Điều kiện chiết xuất này cho dịch chiết chứa cả dạng tự do và dạng kết hợp. Quercetin tự do sau đó đƣợc phân lập b ng các dung môi không phân cực (ethyl axetat).
(2) trích ly b ng H2O (hoặc ethanol, methanol), sau đó thêm axit HCl và ethanol, methanol (hoặc H2O) vào dịch chiết đã chiết xuất để thủy phân [110]. Điều kiện chiết xuất này cho dịch chiết thủy phân chứa chủ yếu là quercetin dạng tự do.
(3) trích ly và thủy phân đồng thời, tiến hành trực tiếp từ bột cây thuốc trong hệ dung môi có axit (hệ dung môi methanol/H2O/HCl hoặc ethanol/H2O/HCl) [110, 171].
Điều kiện chiết xuất này cho dịch chiết chứa chủ yếu là quercetin dạng tự do.
Trong tự nhiên, quercetin tồn tại ở hai dạng chủ yếu là kết hợp và tự do, trong đó dạng kết hợp tồn tại với mức độ nhiều hơn [51]. Quá trình thủy phân từ dạng kết hợp thành tự do, đƣợc thực hiện thông qua sự xúc tác của axit loãng hoặc enzym trong đường tiêu hóa [48]. Khi chiết xuất với dung môi methanol/H2O hoặc ethanol/H2O chứa axit HCl 37%, hàm lƣợng quercetin trong dịch chiết đƣợc ghi nhận gia tăng từ 2 dến 50 lần so với dung môi không chứa axit [51].
Trong các nghiên cứu về định lượng quercetin, phương pháp OMA 2006.07 được công nhận bởi Hiệp hội các nhà hóa học phân tích (AOAC) để xác định quercetin trực tiếp từ mẫu thực vật hoặc sản phẩm thương mại [62]. Phương pháp này được Gray và cộng sự (2005) thiết lập, chuẩn hóa từ nghiên cứu thủy phân các flavonol glycosid (dạng kết hợp) có trong lá bạch quả và các sản phẩm chứa cao chiết lá bạch quả, tạo mẫu chứa flavonol aglycon (dạng tự do) cho phân tích HPLC. Trong nghiên cứu này, hệ dung môi ethanol/H2O/HCl đƣợc khảo sát ở các t lệ thể tích 50:20:7, 50:20:8, 50:20:9; t lệ nguyên liệu/dung môi là 1:50; kĩ thuật chiết hồi lưu ở nhiệt độ 90 oC.
Thời gian khảo sát 01 chu kỳ chiết là 60, 70 và 90 phút để đƣa ra thời gian chiết tối ƣu.
Kết quả nghiên cứu cho thấy r ng với thời gian 60 phút đƣợc lựa chọn cho chiết xuất và thủy phân đồng thời, ở t lệ 50:20:8 của hệ dung môi, dịch sau thủy phân lá bạch quả khô đƣợc xác định có chứa quercetin, kaempferol và isorhamnetin với hàm lƣợng tổng số trung bình khoảng 9,2mg/g nguyên liệu [62]. Sau đó, điều kiện chiết xuất nói trên đƣợc Watanabe và cộng sự (2012) áp dụng để định lƣợng quercetin trong vỏ củ
32
hành tây (Allium cepa L ) [160]. Kết quả cho thấy, điều kiện chiết xuất đã đƣợc Watanabe và cộng sự (2012) áp dụng thành công để tách quercetin từ vỏ hành cho phân tích HPLC. Theo đó, hàm lƣợng quercetin trong vỏ hành đƣợc xác định khoảng 3,48 g/kg nguyên liệu. Gần đây, Nishimuro và cộng sự 2015 đã tiếp tục áp dụng và phát triển điều kiện chiết xuất này để tạo mẫu chứa quercetin từ rau, quả thu hái theo mùa và đồ uống từ trà. Mẫu sau tách chiết đƣợc pha loãng trong methanol và xác định hàm lƣợng quercetin b ng HPLC [110]. Kết quả cho thấy Nishimuro và cộng sự 2015 đã xác định được 16/27 loại nguyên liệu ở dạng tươi, khô, đồ uống từ rau, củ, quả khác nhau, có chứa quercetin với hàm lƣợng dao động từ 1,2 - 41,9 mg/100g nguyên liệu. Nghiên cứu này cũng ghi nhận r ng hành tây có hàm lƣợng quercetin cao nhất (41,9 mg/100g) trong các rau quả đƣợc khảo sát. Hàm lƣợng quercetin trong hành tây thu hái ở mùa đông (41,9 mg/100 g nguyên liệu) đƣợc ghi nhận cao hơn khi thu hái trong mùa hè (11,0 mg/100 g nguyên liệu). Từ kết quả định lƣợng này, mức độ tiêu thụ quercetin theo ngày ở Nhật Bản đƣợc ƣớc lƣợng vào khoảng 16,1 mg/ngày (mùa hè) và 18,3 mg/ngày mùa đông , thông qua việc sử dụng các rau củ quả trong nghiên cứu.
Kĩ thuật chiết xuất là một trong những yếu tố quyết định đến khả năng trích ly quercetin từ nguyên liệu cây thuốc. Nhiều kĩ thuật chiết xuất giống nhau đã đƣợc sử dụng cho các phương pháp khác nhau trong thu nhận quercetin. Kĩ thuật chiết xuất được phát triển từ trích ly truyền thống như ngâm, ngấm kiệt, soxhlet, hồi lưu đến chiết xuất hiện đại nhƣ chiết xuất hỗ trợ siêu âm, hỗ trợ vi sóng. Các kĩ thuật này đƣợc ứng dụng phổ biến để trích ly, tạo mẫu chiết xuất cho phân tích hàm lƣợng flavonoid trong rau, quả và cây thuốc, trong đó có quercetin [110, 160, 171]. Trích ly theo cách truyền thống để thu nhận quercetin thường được thực hiện theo kĩ thuật đun hồi lưu ở nhiệt độ trên nhiệt độ sôi của dung môi (hay gặp là nhiệt độ 90 oC) trong vài giờ hoặc ngâm với dung môi trong nhiều ngày ở nhiệt độ phòng. Những phương pháp này thường tốn thời gian và đòi hỏi lượng lớn dung môi. Những nhược điểm này được cải thiện thông qua kết hợp với chiết xuất theo kĩ thuật có hỗ trợ bởi sóng siêu âm (tần số thông thường từ 20 đến 100 kHz . Kĩ thuật chiết xuất có hỗ trợ siêu âm có thể mang lại khả năng trích ly cao trong thời gian ngắn, thao tác đơn giản, giảm tiêu thụ dung môi, nhiệt độ và năng lƣợng đầu vào thấp hơn [29, 30]. Trong điều kiện siêu âm, hiệu ứng xâm thực mạnh và trộn liên tục tạo ra áp suất cao với sóng xung kích cực mạnh tác
33
động lên nguyên liệu cây thuốc. Khi đó, thành vách tế bào cây thuốc liên tục bị phá vỡ và các thành phần có hoạt tính không thuộc cấu trúc cây thuốc đƣợc tách ra liên tục.
Đồng thời, sự mở rộng vách tế bào làm giảm hàng rào ngăn cản vận chuyển vật chất giữa tế bào cây thuốc và dung môi, do đó đẩy nhanh quá trình giải phóng các thành phần mục tiêu trong thời gian ngắn hơn [30, 170].
Williams và cộng sự 2006 đã nghiên cứu khảo sát kĩ thuật chiết Soxhlet, siêu âm và chiết ở áp suất cao để tách đồng thời quercetin, rutin, quercitrin, isoquercitrin từ lá khô của cây Hypericum perforatum. Trong đó, chiết Soxhlet đƣợc thực hiện trong 24h; chiết siêu âm đƣợc thực hiện ở 60oC trong 120 phút. Chiết xuất ở áp suất cao đƣợc thực hiện ở 15.2 Mpa, nhiệt độ phòng, thực hiện 3 lần, thời gian 5 phút/lần. Hệ dung môi khảo sát gồm methanol, ethanol, tetrahydrofuran, aceton, dichloromethan và hexan. Kết quả thu đƣợc cho thấy dung môi tốt nhất để chiết xuất flavonoid là methanol ở tất cả các kĩ thuật chiết xuất [51]. Trong 3 kĩ thuật, chiết xuất ở áp suất cao cho hiệu quả chiết xuất cao nhất, sau đó đến siêu âm và thấp nhất là chiết Soxhlet [51].
Nghiên cứu của Zhao và Zhang (2018) đã sử dụng kĩ thuật siêu âm để tối ứu hóa điều kiện thu nhận flavonoid từ 86 mẫu lá cây dâu t m (Morus alba). Kết quả nghiên cứu đã ch ra r ng điều kiện chiết xuất phù hợp là siêu âm tần số 40 kHz; chiết 250 mg mẫu nguyên liệu trong 10 ml hệ dung môi ethanol/H2O/HCl (t lệ thể tích 7:2:1) ở nhiệt độ 75 oC và thời gian 60 phút. Trong điều kiện chiết xuất này, hàm lƣợng quercetin và kaempferol dạng aglycon thu nhận được tương ứng khoảng 6,91 mg/ml và 2,06 mg/ml dịch chiết, là cao hơn các nghiên cứu trước đó đã thực hiện trên lá dâu t m cùng loại [171].
Nghiên cứu của Zhao và cộng sự (2019) đã kết hợp kĩ thuật đun hồi lưu với siêu âm để gia tăng hiệu quả chiết xuất. Trong nghiên cứu này, kĩ thuật đun hồi lưu có hỗ trợ siêu âm (công suất 200w) trong methanol 80% ở nhiệt độ 70 oC và thời gian 20 phút, đƣợc thiết lập để tăng hiệu quả thu nhận quercetin, kaempferol, ginkgetin và sciadopitysin từ lá cây thông đỏ (Taxus chinensis). Theo đó, hiệu suất thu nhận quercetin, kaempferol, ginkgetin và sciadopitysin đƣợc xác định lần lƣợt là 0,109, 0,406, 0,031 và 0,355 mg/g, cao hơn khoảng 1,23 hoặc 1,25 lần so với kĩ thuật riêng rẽ đun hồi lưu hoặc siêu âm. Kết quả này đã cho thấy kĩ thuật đun hồi lưu có hỗ trợ siêu âm có nhiều tiềm năng ứng dụng để thu nhận các hoạt chất tự nhiên từ thực vật [170].
34
Cho đến nay, các kết quả nghiên cứu đã ghi nhận r ng ở điều kiện siêu âm cũng như đun hồi lưu sẽ hình thành các gốc tự do có ảnh hưởng bất lợi đến các hợp chất đích. Trong đó, quercetin có hoạt tính chống oxy hóa sẽ bị biến đổi [29]. Qiao và cộng sự (2014) đã nghiên cứu sự ổn định của 14 flavonoid trong điều kiện siêu âm khi sử dụng hai hệ dung môi methanol hoặc ethanol ở dạng không pha loãng hoặc hỗn hợp với H2O. Kết quả đánh giá cho thấy quercetin là flavonoid có sự ổn định kém nhất.
Đồng thời, dung môi methanol cho sự ổn định của quercetin tốt hơn dung môi ethanol [125]. Theo nghiên cứu khác, đƣợc đánh giá bởi Nuutila và cộng sự 2002 , điều kiện chiết xuất kéo dài trong môi trường có hoặc không có HCl sẽ gia tăng sự phân hủy quercetin. Hàm lƣợng quercetin bị suy giảm có thể lên đến 27% khi thủy phân đun hồi lưu ở 80oC trong 120 phút [113]. Trên cơ sở các kết quả nghiên cứu sự ổn định quercetin có thể thấy, điều kiện chiết xuất đƣợc chọn cần dựa trên sự đáp ứng đồng thời về hiệu quả tách quercetin từ nguyên liệu cây thuốc cũng nhƣ sự ổn định của quercetin trong điều kiện chiết xuất [30].
Từ các dữ liệu đã đề cập có thể thấy, trong các phương pháp chiết xuất quercetin, điều kiện chiết xuất theo kĩ thuật đun hồi lưu được Nishimuro và cộng sự (2015) áp dụng, đã được chuẩn hóa trong phương pháp OMA 2006.07 với độ tin cậy cao [62, 110]. Kết quả nghiên cứu theo điều kiện chiết xuất này cho thấy, dịch chiết xuất chứa hỗn hợp các flavonoid dạng aglycon, đặc biệt là các flavonol, trong đó quercetin là thành phần chính. Điều kiện chiết xuất này đƣợc áp thành công trên nhiều loại thực vật để tạo mẫu dịch chiết xuất cho mục đích phân tích HPLC. Tuy nhiên, mẫu chứa quercetin đƣợc thu nhận theo điều kiện chiết xuất này chƣa đƣợc sử dụng để nghiên cứu hoạt tính sinh học. Đồng thời, các nghiên cứu này chƣa thực hiện theo kĩ thuật siêu âm trên dung môi methanol, là dung môi đƣợc ghi nhận có hiệu suất trích ly và ổn định quercetin cao hơn ethanol.
Gần đây, điều kiện thu nhận quercetin theo kĩ thuật siêu âm cũng nhƣ kết hợp đun hồi lưu và siêu âm, trong dung môi ethanol và methanol được Zhao và Zhang 2018 cũng nhƣ Zhao và cộng sự (2019) nghiên cứu triển khai. Các điều kiện chiết xuất theo hai nghiên cứu mới này, đƣợc thiết lập để xác định hàm lƣợng flavonoid tổng số qua hàm lượng quercetin). Nghiên cưu này nh m xác định thành phần ch thị cho các hiệu quả có lợi trong chăm sóc sức khỏe của cây thuốc [170, 171]. Tuy nhiên,
35
điều kiện chiết xuất theo hai nghiên cứu này chƣa đƣợc áp dụng phổ biến trên nhiều loại thực vật. Đồng thời, chế phẩm chứa quercetin sau thu nhận chƣa đƣợc chuẩn hóa cho nghiên cứu hoạt tính sinh học.
Nhƣ vậy, các điều kiện chiết xuất đã đề cập có nhiều tiềm năng để tạo chế phẩm quercetin từ cây thuốc cho nghiên cứu hoạt tính sinh học. Tuy nhiên, cho đến nay các điều kiện chiết xuất đó chƣa đƣợc ứng dụng để tạo chế phẩm giàu quercetin từ cây thuốc cho nghiên cứu hoạt tính sinh học, nh m phát triển làm nguyên liệu sản xuất các sản phẩm chăm sóc sức khỏe. Hơn nữa, nghiên cứu sự ổn định của quercetin trong các điều kiện chiết xuất đƣợc đề cập bởi các tác giả này cũng chƣa đƣợc thực hiện.
1.3.4.2. Chiết xuất quercetin từ cây thuốc tạo nguyên liệu ứng dụng trong lĩnh vực thực phẩm và y dược
Trong tự nhiên, quercetin tồn tại ở dạng aglycon hoặc glycosid trong nhiều loài cây thuốc cũng nhƣ rau quả. Hàm lƣợng quercetin trong một số thực vật làm thuốc và thực phẩm.đƣợc thể hiện ở bảng 1.2 [17].
Bảng 1.2. Hàm lƣợng quercetin trong một số thực vật phổ biến để làm thuốc và thực phẩm
Nguyên liệu thực vật Hàm lƣợng quercetin (mg/100g nguyên liệu)
Bạch hoa 233,84
Tiêu cay vàng 50,73
Hành tây 34,80
Măng tây 15,16
Nam việt quất 14,84
Lá trà xanh đƣợc pha 2,49
Trà đen đƣợc pha 2,19
Quả nho đen 2,08
Quả nho xanh 1,12
Rƣợu vang đỏ 1,04
Rƣợu vang trắng 0,04
Đài hoa bụp giấm 0,89
Lá chùm ngây 384,60
Rau má 1,09
Lá sen 5,60
Nụ hoa hòe 0,57
Quả ngũ vị tử 0,013
Theo các nghiên cứu dịch tễ, chế độ ăn giàu flavonoid chủ yếu chứa nhóm flavonol (quercetin, myricetin, kaempferol) và nhóm flavon (apigenin, luteolin) [14].
36
Trong đó, quercetin chiếm t lệ khoảng 70% tổng lƣợng flavonoid đƣợc tiêu thụ trong chế độ ăn nhiều rau quả [17, 35]. Theo đánh giá chế độ ăn uống tại các nước Úc, Phần Lan, Hà Lan, Mỹ lƣợng quercetin đƣợc tiêu thụ hàng ngày khoảng 5- 40 mg. Tuy nhiên, lƣợng quercetin đƣợc hấp thu /ngày có thể lên đến 200-500 mg, khi bữa ăn có nhiều các loại rau quả có vỏ nhƣ cà chua, táo, hành [17].
Trong các loại rau quả ở bảng 1.2, hành tây (Allium cepa L ) thuộc họ hành (Alliaceae) là thực phẩm đƣợc sử dụng nhiều trong chế độ ăn ở Nhật Bản và một số nước phương tây [8, 160]. Vỏ hành tây được xác định giàu quercetin và các flavonoid khác, là nguyên liệu đƣợc chú trọng cho nghiên cứu chiết xuất quercetin ở dạng tự do hoặc dẫn xuất. Theo nghiên cứu của Watanabe và cộng sự 2012 , khi chiết xuất theo phương pháp OMA 2006.07, hàm lượng quercetin trong hành tây Nhật Bản được xác định khoảng 3,48 g/kg [160].
Ở các nước như Mỹ, Canada, Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc, cùng với chế độ dinh dƣỡng có nhiều rau quả, quercetin tinh khiết đƣợc thu nhận từ thủy phân hoạt chất rutin (quercetin-3-O-rutinosid) trong môi trường axit, để gia tăng ứng dụng trong lĩnh vực y dƣợc [156, 166]. Quercetin tinh khiết đƣợc dùng làm chất chuẩn trong nghiên cứu hóa lý, dƣợc lý hoặc nguyên liệu sản xuất thực phẩm, thực phẩm chức năng và mỹ phẩm [46, 51, 156, 166]. Cho đến nay, hướng nghiên cứu phát triển điều kiện chiết xuất theo phương pháp OMA 2006.07 để thu nhận chế phẩm quercetin trực tiếp từ cây thuốc hoặc thủy phân từ rutin từ tách từ cây thuốc, chƣa đƣợc thực hiện.
Trong số 180 glycosid-hợp chất dẫn xuất của quercetin đƣợc tìm thấy trong cây thuốc, phổ biến nhất là rutin (quercetin-rutinosid). Ở Việt Nam và các nước châu Á, rutin chủ yếu tách từ nụ hoa hòe Sophora japonica L , thuộc họ Đậu (Fabaceae) [108]. Cây hòe là dƣợc liệu phổ biến ở Việt Nam, phân bố nhiều ở Thái Bình, Nam Định và một số t nh phía Bắc [2]. Cho đến nay đã xác định đƣợc 39 flavonoid trong hoa hòe, trong đó rutin dẫn xuất quercetin-3-O-rutinosid) là thành phần chính chiếm từ 6% - 20%. Rutin khi thủy phân sẽ cho quercetin, ramnoza và glucoza [67]. Trong một nghiên cứu khác, hàm lƣợng rutin và quercetin tự do trong nụ hoa hòe đƣợc Li và cộng sự (2002) xác định lần lƣợt khoảng 14,75 mg/g và 0,57 mg/g [93].
Nhƣ vậy, với đặc tính hóa học và sinh học độc đáo, chế phẩm quercetin tinh khiết thu nhận từ quá trình thủy phân rutin, đƣợc chú trọng nghiên cứu về hoạt tính chống