Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả thu nhận quercetin từ cây thuốc gồm khả năng trích ly hợp chất mong muốn từ cây thuốc, hiệu suất thủy phân dịch chiết, sự ổn định của quercetin trong điều kiện chiết xuất và sự chính xác của phương pháp phân tích quercetin [15, 29, 32, 170]. Các vấn đề này đã đƣợc đề cập chủ yếu trong các nghiên cứu riêng rẽ về xác định hàm lượng quercetin theo phương pháp HPLC hoặc thu nhận mẫu cho nghiên cứu hoạt tính sinh học.Việc đánh giá có hệ thống các vấn đề này trong cùng một nghiên cứu thu nhận quercetin từ thực vật, để tạo chế phẩm quercetin cho xác định hàm lƣợng cũng nhƣ hoạt tính sinh học là chƣa đƣợc đề cập.
Từ kết quả thực nghiệm và đánh giá hiệu quả thủy phân cũng nhƣ sự ổn định trên chất chuẩn (quercetin và rutin), khả năng trích ly thu dịch chiết (ở 15 hoặc 30 phút) và hiệu quả thủy phân (ở 60 phút đƣợc áp dụng thử nghiệm trên nụ hoa hòe chuẩn. Nụ hoa hòe chuẩn đƣợc lựa chọn thử nghiệm để đảm bảo sự đồng đều về hàm lƣợng hoạt chất (rutin) khi chiết xuất. Kết quả thu đƣợc cho thấy với thời gian trích ly 15 và 30 phút chưa đủ để trích ly hết ruitn có trong nụ hoa hòe. Trong trường hợp này, các nghiên cứu trước đây đã lựa chọn tăng thời gian trong một lần chiết hoặc tăng số chu kỳ chiết để gia tăng lƣợng hợp chất đích trong dịch chiết với mong muốn là chiết kiệt hợp chất trong nguyên liệu [147]. Giải pháp này là phù hợp khi áp dụng trên khối lƣợng chiết xuất nhỏ và đã đƣợc chúng tôi tiếp cận và áp dụng trong nghiên cứu về hàm lƣợng quercetin trong 10 cây thuốc. Tuy nhiên, nghiên cứu của chúng tôi đã cho thấy r ng, sự ổn định của quercetin sẽ giảm nếu gia tăng thời gian trích ly. Trong đó, nhiệt độ cao ở thời gian dài gây giảm mạnh hàm lƣợng quercetin. Chúng tôi đề xuất và áp dụng giải pháp là không tăng số chu kỳ chiết của kĩ thuật siêu âm mà cần kết hợp với kĩ thuật chiết xuất khác. Kĩ thuật kết hợp đƣợc lựa chọn cần tiến hành ở nhiệt độ thấp để đảm bảo sự ổn định của quercetin cũng nhƣ thuận lợi cho thay đổi chu kỳ chiết thường là tăng lên với khả năng tái lập cao khi áp dụng ở các quy mô có khối lƣợng chiết xuất khác nhau. Trong nghiên cứu của chúng tôi, kĩ thuật siêu âm ở nhiệt độ 70 oC đã có hiệu quả trong việc phá vách tế bào, khi đó kĩ thuật ngâm kiệt đƣợc lựa
127
chọn kết hợp nh m tiếp tục thu kiệt dịch chiết chứa quercetin từ cây thuốc. Kĩ thuật ngâm kiệt ở nhiệt độ phòng đƣợc lựa chọn để đảm bảo sự ổn định của quercetin theo thời gian (theo nhiệt độ phòng) và số chu kỳ chiết đƣợc tăng lên dựa trên tốc độ nhỏ giọt và thời gian chiết tương ứng với lượng nguyên liệu, dung môi và thiết bị ngấm kiệt) [167]. Trong luận án kĩ thuật ngâm kiệt đƣợc sử dụng để thu kiệt dịch chiết, thực hiện ngay sau giai đoạn trích ly và trước khi thủy phân. Trên cơ sở đó, điều kiện chiết xuất đƣợc xác định là trích ly thu dịch chiết b ng kĩ thuật siêu âm kết hợp với ngâm kiệt trong dung môi methanol 72%, tiếp đến là bổ sung HCl 37% để thủy phân dịch chiết b ng kĩ thuật siêu âm, thu chế phẩm cao chiết chứa quercetin. Kết quả đánh giá cho thấy khi kết hợp với ngâm kiệt, hiệu quả trích ly đã đƣợc gia tăng. Các điều kiện này tiếp tục đƣợc áp dụng để đánh giá về hiệu quả thu nhận và hoạt tính chống oxy hóa của 10 cao chiết từ 10 nguyên liệu từ 10 cây thuốc. Kết quả đánh giá cho thấy, điều kiện chiết xuất là phù hợp để thu nhận mẫu quercetin từ các cây thuốc có hàm lƣợng quercetin khác nhau, với hiệu suất thu nhận và khả năng tái lặp đạt yêu cầu. Các kết quả đánh giá cho thấy hàm lƣợng quercetin và hoạt tính của cao chiết sau thủy phân cao hơn trước thủy phân.
Nhƣ vậy, luận án đã phát triển thành công điều kiện chiết xuất tham khảo để thu nhận chế phẩm quercetin trên khối lƣợng nguyên liệu lớn hơn của cây thuốc, cho nghiên cứu hoạt tính sinh học [110, 170, 171]. Tiến trình thực nghiệm và đánh giá có hệ thống về các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả thu nhận quercetin trên 10 cây thuốc, để xây dựng quy trình thu nhận chế phẩm quercetin cho nghiên cứu hàm lƣợng và hoạt tính sinh học, đƣợc thực hiện trong nghiên cứu của chúng tôi là chƣa đƣợc đề cập trong các công trình nghiên cứu trước đây. Các dữ liệu nghiên cứu, lựa chọn, đánh giá về sự ổn định và hiệu quả thủy phân trên các chất chuẩn cũng nhƣ thực nghiệm trên nụ hoa hòe chuẩn và khảo nghiệm thu nhận cao chiết chứa quercetin từ 10 cây thuốc, đạt mục tiêu đề ra về hiệu suất thu nhận cao và chất lƣợng tốt (hoạt tính chống oxy hóa cao hơn , là đóng góp mới của luận án.
Hiện nay, chế phẩm quercetin sử dụng phổ biến trong nghiên cứu và ứng dụng là dạng tinh khiết, chủ yếu đƣợc thu nhận từ thủy phân rutin, một dạng quercetin glycosid có trong cây thuốc. Ở Việt Nam và một số nước châu Á, rutin được thu nhận chủ yếu từ nụ hoa hòe [3, 157]. Trước nghiên cứu của chúng tôi, thu nhận dạng bán
128
tinh khiết của quercetin từ nụ hoa hòe và so sánh với chế phẩm quercetin tinh khiết từ rutin (tách từ nụ hoa hòe) là chƣa đƣợc thực hiện.
Trong điều kiện chiết xuất theo nghiên cứu của chúng tôi, hiệu quả thu nhận và hoạt tính sinh học của nụ hoa hòe và lá sen là tốt nhất trong các cây thuốc. Hai cây thuốc này đƣợc lựa chọn để thu nhận mẫu chứa quercetin cho đánh giá hoạt tính sinh học. Trên cơ sở điều kiện thu cao chiết đã thiết lập, 02 quy trình thu nhận chế phẩm quercetin từ lá sen và nụ hoa hòe đã đƣợc nghiên cứu và xây dựng. Tiến hành theo quy trình thiết lập, chúng tôi đã thu nhận đƣợc 02 chế phẩm quercetin bán tinh khiết (gồm 01 từ nụ hoa hòe (H1) và 01 từ lá sen (S)) và 01 chế phẩm quercetin tinh khiết từ rutin của nụ hoa hòe (H2). Kết quả tinh chế và định tính quercetin có trong các chế phẩm cho thấy quercetin kết tinh màu vàng, nhiệt độ nóng chảy từ 316-317 oC, dễ tủa trong ethanol ở nồng độ thấp và nhiệt độ lạnh, có Rf tương đương mẫu quercetin chuẩn. Kết quả giải đồ tần số theo các nhóm –OH, phenol, C=O, C=C, C-H, cấu trúc theo mặt phẳng, C-O aryl, C-O phenol và C-CO-C kenton của vết điều chế b ng SKBM từ sắc ký đồ trên bản mỏng Silicagel của 3 mẫu (H1, H2, S) và 2 quercetin chuẩn (QC, QUE) là tương đồng với phổ đồ IR của quercetin trong nghiên cứu của Shaghavi và cộng sự (2011), Catauro và cộng sự (2015) cũng nhƣ Ratna và cộng sự (2019) [37, 51, 128, 136].
Theo quy trình đã thiết lập, chế phẩm thu nhận từ hoa hòe có hàm lƣợng quercetin cao hơn khoảng 6 đến 9 lần chế phẩm thu nhận từ lá sen. Trong 02 quy trình thu nhận chế phẩm quercetin từ nụ hoa hòe, quy trình thu nhận chế phẩm bán tinh khiết (H1) nhận được nhiều quercetin hơn phương pháp thu nhận mẫu tinh khiết từ rutin (H2) khi tính theo 100 g nguyên liệu nụ hoa hòe. Kết quả này cho thấy, từ điều kiện chiết xuất tham khảo, nghiên cứu của chúng tôi đã thiết lập đƣợc quy trình thu nhận chế phẩm quercetin dạng bán tinh khiết từ dịch chiết toàn phần lá sen và nụ hoa hòe cho nghiên cứu hoạt tính sinh học. Các dữ liệu về nghiên cứu, thu nhận chế phẩm quercetin từ nụ hoa hoe và lá sen theo 02 quy trình đƣợc xây dựng, là đóng góp mới của luận án.
129