Đánh giá đặc tính chống oxy hóa của chế phẩm chiết xuất

1.4. XÁC ĐỊNH HỢP CHẤT ĐÍCH VÀ HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA CỦA CHẾ PHẨM CHIẾT XUẤT

1.4.2. Đánh giá đặc tính chống oxy hóa của chế phẩm chiết xuất

Nhiều nghiên cứu đã ch ra r ng hiệu quả cải thiện sức khỏe của cây thuốc, liên quan đến tình trạng stress oxy hóa của cơ thể, là nhờ vào những thành phần có hoạt tính chống oxy hóa trong mẫu chiết xuất [79, 126]. Khi đó, hoạt tính chống oxy hóa của mẫu chiết xuất được đánh giá theo các bước từ mức độ in vitro đến in vivo, tùy thuộc vào mục tiêu tác dụng của mẫu và điều kiện thực hiện. Sàng lọc hoạt tính chống oxy hóa hóa học in vitro, thường sử dụng các thử nghiệm hóa học dựa trên cơ chế hoạt động của chất chống oxy hóa sẽ có mô hình thử nghiệm để đánh giá khả năng cho electron và nguyên tử hydro của chất chống oxy hóa. Mỗi mô hình có thể sử dụng thuốc thử là chất oxy hóa khác nhau [122]. Nhƣ vậy, mỗi mô hình thử nghiệm ch cho thấy một khía cạnh về hoạt tính chống oxy hóa của chất, do đó để đánh giá khả năng chống oxy hóa cần phải sử dụng nhiều hơn một mô hình thử nghiệm [165].

Sàng lọc hóa học in vitro có ƣu điểm là đơn giản, rẻ tiền, có thể thực hiện hàng loạt. Các chất hóa học thường gặp để sàng lọc đó là DPPH, phosphomolybdenum và ion Fe3+. Theo đó, các phương pháp sử dụng phổ biến trong phòng thí nghiệm để đánh giá hoạt tính chống oxy hóa là đánh giá khả năng cho electron, cho hydro hoặc tham gia vận chuyển electron [122]. Tuy nhiên, đây ch là thử nghiệm bước đầu, vì chất có hoạt tính chống oxy hóa tốt trong mô hình thử nghiệm hóa học chƣa chắc đã có hiệu quả cao về hoạt tính chống oxy hóa trong cơ thể sinh vật.

Phương pháp đánh giá khả năng cho electron được thực hiện thông qua đánh giá lực chống oxy hóa tổng đối với phosphomolybdenum (TAC). Tiến hành dựa trên khả năng khử Mo+6 về Mo+5 tạo phức màu xanh lá cây trong môi trường axit. Phương pháp có ƣu điểm là đơn giản, nhanh chóng, tuyến tính tốt với nồng độ chất chống oxy hóa.

Nhƣng nhƣợc điểm là các hợp chất có khả năng cho electron ngay cả khi không có các đặc tính chống oxy hóa) có thế oxy hóa khử thấp hơn cặp Mo VI /Mo V đều đóng góp vào giá trị TAC, dẫn đến sai số [122, 124].

44

Phương pháp đánh giá khả năng cho nguyên tử hydro được thực hiện thông qua khả năng quét gốc tự do DPPH. Tiến hành dựa trên khả năng làm giảm màu của DPPH (màu hồng , được xác định b ng cách đo quang ở bước sóng 517 nm. Phương pháp có ƣu điểm là dễ dàng, hiệu quả và nhanh chóng, phù hợp đối với nhiều đối tƣợng mẫu.

Nhược điểm là DPPH tan trong các dung môi hữu cơ nhưng tan hạn chế trong nước.

Hiện nay, phương pháp này được sử dụng phổ biến trong đánh giá hoạt tính chống oxy hóa in vitro và kết hợp với phương pháp HPLC trong sàng lọc các hợp chất chống oxy hóa trực tiếp từ dịch chiết cây thuốc [69, 71, 122].

Phương pháp năng lực khử, được thực hiện dựa trên nguyên tắc mẫu thử sẽ khử ion Fe3+ trong phân tử kali ferricyanid (K3[Fe(CN)6]) thành ion Fe2+ trong phân tử kali ferrocyanid (K4[Fe(CN)6]). Khi bổ sung FeCl3, Fe3+ sẽ phản ứng với ion ferrocyanid tạo thành phức hợp ferris ferrocyanid (K4[Fe(CN)6]3 màu xanh dương. Phương pháp có ƣu điểm là dễ dàng, hiệu quả và nhanh chóng, phù hợp đối với rất nhiều đối tƣợng mẫu, nhƣng nhƣợc điểm là tốn dung môi [71, 122].

Mối liên hệ giữa hoạt tính chống oxy hóa với đặc tính tiền chất oxy hóa đƣợc biểu diễn qua ch số ProAtindex (Pro-oxidant/Anti-oxidant). Ch số này đƣợc thiết lập b ng cách lấy nồng độ mẫu tại giá trị IC50 của phản ứng DPPH chia cho nồng độ mẫu tại giá trị có độ hấp thụ Abs= 1 (phản ứng năng lực khử). Hợp chất flavonoid vừa có đặc tính chống oxy hóa (anti-oxidant) vừa có thể là gốc oxy hóa (Pro-oxidant) dựa trên nồng độ sử dụng. Đây là ch số mới đƣợc đề xuất những năm gần đây, để đƣợc thiết lập thể hiện mối liên hệ giữa hai hoạt tính này trên cùng một đối tƣợng nghiên cứu.

Giá trị ch số ProAtindex, càng cao chứng tỏ mẫu càng có hoạt tính pro-oxidant và ngƣợc lại [94].

Khi chƣa rõ hợp chất đích việc đánh giá hoạt tính chống oxy hóa đƣợc thực hiện dựa trên hàm lƣợng tổng số của các hợp chất phenol và flavonoid. Khi đó, áp dụng phương pháp trắc quang tạo màu với thuốc thử Folin – Ciocalteu và phản ứng tạo phức màu của các flavonoid với ion Al3+ trong môi trường kiềm để xác định các ch tiêu này [79]. Ngoài ra có thể sử dụng các phương pháp đánh giá khả năng hấp thụ gốc oxy hóa (ORAC); xác định hoạt tính khử Cu2+ (CUPRAC); đánh giá hoạt tính chống oxy hóa tổng cộng (TRAP) và xác định hoạt tính khử Fe3+ FRAC để nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa. Tuy nhiên, các phương pháp này đòi hỏi quá trình tiến

45

hành phức tạp hơn, khó xác định điểm kết thúc của phản ứng cũng như ảnh hưởng nhiều bởi nền mẫu [122]. Vì vậy, mức độ áp dụng để đánh giá cũng hạn chế hơn, không thực sự phổ biến như các phương pháp đã trình bày ở trên .

Sàng lọc hoạt tính chống oxy hóa sinh học in vivo đƣợc thực hiện trên động vật thử nghiệm (chuột, thỏ... và thường bị gây tổn thương b ng tác nhân hóa học có tính chất oxy hóa (CCl4, paracetamol liều cao) hoặc cho tiếp xúc với điều kiện bất lợi (stress nhiệt, bơi cƣỡng bức). Thử nghiệm độc tính và hoạt tính chống oxy hóa theo hướng bảo vệ tế bào trên cơ thể động vật bị gây tổn thương bởi chất oxy hóa được đánh giá thông qua các ch tiêu huyết học, ch tiêu hóa sinh máu (ALT,enzym AST, creatinin, ure,..) và các chất ch thị cho tinh trạng stress oxy hóa (MDA, GSH,..) và các ch tiêu hành vi của động vật thí nghiệm [90, 129].

46 Chương 2