2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.4. Nhóm phương pháp đánh giá hoạt tính in vivo
Các mẫu chứa quercetin lựa chọn sau khảo sát hoạt tính in vitro, đƣợc thử nghiệm in vivo gồm thử trên động vật thí nghiệm về độc tính và hoạt tính chống oxy hóa, các test hành vi về sinh lý thích nghi.
Chuột đực Swiss albino (25-30 g , được nuôi 1 tuần trước khi làm thí nghiệm ởnhiệt độ nuôi 27oC ± 3oC, độ ẩm 60-70%, chế độ sáng 12/12h. Mỗi lô nghiên cứu tối
64
thiểu 8 con, lặp lại 4-5 lần/lô. Mẫu thí nghiệm được sử dụng qua đường uống. Các mẫu thử hoạt tính được hòa tan trong DMSO, sau đó được phân tán vào nước cất pha tiêm DMSO đạt khoảng 0,5% và dùng qua đường uống b ng sử dụng kim chuyên dụng dành cho chuột nhắt, thể tích cho uống là 0,2ml /10g /lần uống [1, 20]. Chuột nghiên cứu đƣợc chia thành các nhóm, mỗi nhóm 32 con. Sau 18 – 22h kể từ khi kết thúc thí nghiệm, chuột ở tất cả các lô đƣợc tiến hành lấy máu hốc mắt và giải phẫu [38]. Đối với phương pháp nghiên cứu sốc nhiệt, chuột được tiến hành lấy mẫu ngay sau khi kết thúc thí nghiệm, gồm mẫu máu và cơ quan cho phân tích hóa sinh, huyết học và các ch tiêu khác.
2.2.4.2. Phương pháp nghiên cứu độc tính giữa các mức liều lựa chọn
Theo nghiên cứu của Yao và cộng sự (2018), lƣợng quercetin tiêu thụ hàng ngày từ rau, quả trung bình khoảng 20,9 ± 2,32 mg/ngày [167]. Vì vậy, mức liều 10 mg/kg và 20 mg/kg đƣợc lựa chọn cho nghiên cứu hiệu quả chống oxy hóa in vivo. Trong nghiên cứu của chúng tôi, mức liều hiệu quả định hướng 10, 20 mg/kg và mức liều 250 mg/kg gấp trên 12 lần được sử dụng qua đường uống. Độc tính của các mức liều đƣợc đánh giá về độc tính cấp và quan sát các ch tiêu về hóa sinh, huyết học của chuột nghiên cứu. Độc tính cấp giữa các mức liều 10, 20 và 250 mg/kg của các mẫu đƣợc thử hoạt tính gây chết chuột thí nghiệm, đánh giá theo phương pháp của Litchfield – Wilcoxon cũng nhƣ theo mô tả bởi Tùng và cộng sự [11]. Chuột đƣợc chia ngẫu nhiên thành các nhóm nhƣ sau:
- Nhóm đối chứng âm (n=32): sử dụng DMSO 0,5%, mức 0,2ml/10g/lần uống.
Sử dụng sản phẩm liên tục trong 7 ngày
- Các nhóm đối chứng dương (n=32/nhóm): sử dụng quercetin chuẩn mẫu QUE), pha trong DMSO 0,5%, chia làm 3 nhóm tương ứng với 3 mức liều 10 mg/kg, 20 mg/kg, 250 mg/kg. Sử dụng sản phẩm liên tục trong 7 ngày
- Các nhóm nghiên cứu (n=32/nhóm): sử dụng mẫu chứa quercetin, gồm chế phẩm H1và H2. Lô nghiên cứu đƣợc chia làm 6 nhóm. Mỗi nhóm đƣợc sử dụng chế phẩm H1 hoặc H2, tương ứng với các mức liều 10, 20 và 250 mg/kg, Sử dụng sản phẩm liên tục trong 7 ngày.
Ch tiêu đánh giá: Chuột trong các nhóm đƣợc theo dõi về trọng lƣợng, hành vi, t lệ chết ở các thời điểm ban đầu, sau 72h và liên tục đến 7 ngày. Sau 7 ngày, tiến
65
hành mổ khám đại thể gan, thận và xét nghiệm một số ch số hóa sinh hoạt độ enzym AST và ALT, creatinin, ure, albumin, bilirubin toàn phần TP , bilirubin trực tiếp (TT) , huyết học số lƣợng bạch cầu, hồng cầu, hemoglobin và ch số chống oxy hóa in vivo (MDA, GSH) trong gan. Từ đó lựa chọn đƣợc liều nghiên cứu phù hợp.
2.2.4.3. Phương pháp sốc nhiệt thực nghiệm và đánh giá khả năng cải thiện theo cách thức sử dụng của các mẫu chứa quercetin
Phương pháp sốc nhiệt được tiến hành dựa trên các nghiên cứu của Chen và cộng sự (2014) (sốc nhiệt mạn tính); Abdelnasir và cộng sự (2014) (sốc nhiệt cấp tính) [12, 38, 53].
a. Khảo sát, lựa chọn hình thức sốc nhiệt: Sử dụng tác nhân nhiệt độ tác động lên chuột thí nghiệm với 2 cấp độ là sốc nhiệt mạn tính và sốc nhiệt cấp tính.
- Sốc nhiệt mạn tính: chuột đƣợc đƣa vào trong thiết bị buồng tăng thân nhiệt, tăng nhiệt độ với tốc độ 1 oC/phút đến khi đạt 39,5 oC, độ ẩm trong môi trường nghiên cứu là 30 – 40%. Duy trì nhiệt độ 39 – 40 oC, độ ẩm 30 – 40% trong 2 giờ. Theo dõi nhiệt độ thân nhiệt của chuột nghiên cứu tại các thời điểm 20, 40, 60, 80, 100, 120 phút. Sau đó, hạ nhiệt độ xuống về nhiệt độ môi trường, tốc độ hạ nhiệt 0,5 oC/ phút.
Đo thân nhiệt chuột lần cuối trước khi kết thúc thí nghiệm.
- Sốc nhiệt cấp tính: chuột được đưa vào môi trường nghiên cứu 42 - 43 oC, độ ẩm 30- 40% đã đƣợc duy trì trong thiết bị buồng tăng thân nhiệt với thời gian 15 phút.
Theo dõi nhiệt độ thân nhiệt chuột trước, trong và sau quá trình sốc nhiệt.
Thời gian thí nghiệm và ch tiêu quan sát: Thời gian thực hiện mô hình sốc nhiệt mạn tính là 5 ngày, 1 lần/ ngày. Sốc nhiệt cấp tính ch thực hiện một lần duy nhất. Mẫu máu và các cơ quan nội tạng đƣợc lấy ngay sau 5 ngày sốc nhiệt mạn tính hoặc ngay sau khi sốc nhiệt cấp tính. Các mẫu máu đƣợc phân tích ch số AST và quan sát các hành vi cũng nhƣ t lệ chuột sống/chết.
b. Gây mô hình và đánh giá hiệu quả can thiệp các mẫu chứa quercetin
Trên cơ sở mức liều đƣợc lựa chọn của các mẫu chứa quercetin thu nhận từ cây thuốc đƣợc lựa chọn ở nội dung nghiên cứu độc tính và mô hình sốc nhiệt đƣợc lựa chọn, phương pháp đánh giá hiệu quả của các mẫu trên chuột bị sốc nhiệt được tiến hành trên các lô, mỗi lô 31 cá thể chuột.
- Nhóm đối chứng (n=32/nhóm): DMSO 0,5%, 0,2 ml/10g thể trọng/lần uống.
66
- Nhóm sốc nhiệt (n=32/nhóm): sử dụng mô hình sốc nhiệt đƣợc lựa chọn.
- Nhóm đối chứng dương (n=32/nhóm): Sử dụng quercetin chuẩn mẫu QUE với 01 mức liều (lựa chọn đƣợc sau nghiên cứu độc tính cấp , theo cách thức dự phòng dùng trước 7 ngày, trước khi sốc nhiệt .
- Các nhóm nhóm nghiên cứu n=32/nhóm): Sử dụng mẫu chứa quercetin, gồm chế phẩm H1và H2, với 01 mức liều lựa chọn đƣợc sau nghiên cứu độc tính cấp , theo cách thức dự phòng dùng trước 7 ngày, trước khi sốc nhiệt .
Ch tiêu quan sát và đánh giá: hành vi, t lệ chuột chết, hình ảnh đại thể gan và hoạt độ AST trong huyết thanh, ch số chống oxy hóa in vivo (MDA, GSH) trong gan.
2.2.4.4. Phương pháp gây độc gan thực nghiệm bằng paracetamol và đánh giá khả năng cải thiện theo cách thức sử dụng của các mẫu chứa quercetin
Phương pháp gây mô hình viêm gan b ng paracetamol được tiến hành dựa trên các nghiên cứu của Mallhi và cộng sự (2018), Sabir và cộng sự (2008) [46, 99, 100, 133, 166].
a. Khảo sát mức liều phù hợp của paracetamol: Paracetamol đƣợc sử dụng theo các mức liều từ thấp đến khoảng liều LD50 với thời gian theo dõi từ 72 h đến 7 ngày để lựa chọn mức liều phù hợp. Chuột đƣợc phân thành các lô, gồm lô đối chứng và lô paracetamol theo các mức liều: 150, 250, 350, 400 và 500 mg/kg. Các ch tiêu đƣợc quan sát và đánh giá gồm hành vi, t lệ chuột chết, hình ảnh đại thể gan và hoạt độ enzym AST trong huyết thanh.
b. Gây mô hình và đánh giá hiệu quả can thiệp các mẫu chứa quercetin trên chuột sử dụng paracetamol, theo cách thức sử dụng khác nhau:
- Nhóm đối chứng (n=32): DMSO 0,5%, sử dụng mức 0,2 ml/10 g thể trọng/lần uống, sử dụng liên tục trong 7 ngày
- Nhóm paracetamol (n=32): Sử dụng paracetamol ở mức liều đƣợc lựa chọn, sử dụng vào thời điểm 9h30-10h trong ngày, 1 lần/ngày, liên tục trong 7 ngày.
- Nhóm đối chứng dương, dự phòng QUE (n=32): sử dụng mẫu QUE ở mức liều lựa chọn sau nghiên cứu độc tính vào thời điểm 6h30-7h trong ngày, sau thời điểm đó 3h, paracetamol (ở mức liều đƣợc lựa chọn đƣợc dùng bổ sung vào thời điểm 9h30-10h) trong ngày, 1 lần/ngày, liên tục trong 7 ngày.
67
- Nhóm đối chứng dương, hỗ trợ điều trị QUE (n=32): sử dụng paracetamol (ở mức liều đƣợc lựa chọn) vào thời điểm 9h30-10h trong ngày, sau thời điểm đó 3h, mẫu QUE ở mức liều lựa chọn sau nghiên cứu độc tính đƣợc dùng bổ sung vào thời điểm 12h30-13h, 1 lần/ngày, liên tục trong 7 ngày
- Nhóm nghiên cứu dự phòng H1 hoặc H2: sử dụng mẫu H1 hoặc H2 ở mức liều lựa chọn sau nghiên cứu độc tính vào thời điểm 6h30-7h trong ngày, sau thời điểm đó 3h, paracetamol (ở mức liều đƣợc lựa chọn) đƣợc dùng bổ sung vào thời điểm 9h30-10h trong ngày, 1 lần/ngày, liên tục trong 7 ngày
- Nhóm nghiên cứu hỗ trợ điều trị H1 hoặc H2: sử dụng paracetamol (ở mức liều đƣợc lựa chọn) vào thời điểm 9h30-10h trong ngày, sau thời điểm đó 3h, mẫu H1 hoặc H2 ở mức liều lựa chọn sau nghiên cứu độc tính đƣợc dùng bổ sung vào thời điểm 12h30-13h, 1 lần/ngày, liên tục trong 7 ngày.
Các ch tiêu quan sát và đánh giá: hành vi, t lệ chuột chết, hình ảnh đại thể gan và hoạt độ enzym AST, ALT trong huyết thanh, ch số chống oxy hóa in vivo (MDA, GSH) trong gan.
2.2.4.5. Phương pháp thu thập mẫu, kiểm tra trực quan và phân tích các chỉ số cảm quan, hành vi, hóa sinh, huyết học, MDA, GSH
- Kiểm tra trực quan gan: Sau thí nghiệm và lấy máu xét nghiệm, chuột đƣợc mổ để kiểm tra trực quan. Chụp ảnh gan động vật thí nghiệm [1].
- Phân tích ch số hóa sinh, huyết học tại Học viện Quân y.
+ Máu sau khi đƣợc thu b ng ống lấy mẫu chứa chất chống đông EDTA , ly tâm tốc độ không quá 10.000 vòng/phút khoảng 5000 đến 8000 vòng/phút) trong 5 phút và đo các ch số nghiên cứu.
+ Các ch số huyết học (số lƣợng bạch cầu, hồng cầu, hemoglobin đƣợc định lƣợng trên máy phân tích huyết học tự động EXIGO Thụy Điển .
+ Các ch số hóa sinh AST và ALT, creatinin, ure, glucose, triglycerid, albumin, protein toàn phần, bilirubin toàn phần TP , bilirubin trực tiếp TT , cholesterol trong huyết tương) được định lượng trong huyết tương chuột b ng phương pháp so màu, thực hiện trên máy định lƣợng sinh hoá bán tự động AU680 của hãng Beckman Coulter [20].
68
- Xác định hàm lƣợng malondialdehyde (MDA) và glutathione (GSH) theo phương pháp của Ohkawa và cộng sự (1979) cũng như Moron và cộng sự (1979), đƣợc mô tả trong nghiên cứu của Nguyễn Bảo Trân và cộng sự (2011) [10] : Gan chuột đƣợc tách, bổ sung dung dịch KCl 1,15 % và nghiền đồng thể ở nhiệt độ khoảng 4o C. Dịch đồng thể đƣợc lấy 2 ml thêm dung dịch đệm Tris pH = 7,4 vừa đủ 3 ml.
Hỗn hợp phản ứng ở 37oC đƣợc ủ trong 1 giờ, dừng phản ứng b ng TCA 10% và ly tâm thu dịch trong.
+ Định lƣợng MDA: 2 ml dịch trong đƣợc lấy để phản ứng với 1 ml axit thiobarbituric 0,8 % ở 100 oC trong khoảng 30 phút. Sau đó, đo mật độ quang ở λ = 532 nm. Hàm lượng MDA nM/g được tính theo phương trình hồi quy tuyến tính của chất chuẩn MDA.
+ Định lƣợng GSH: 1 ml dịch trong đƣợc cho phản ứng với 0,2 ml thuốc thử Ellman (5,5‟– dithiobis–2–nitrobenzoic axit). Sau đó đệm EDTA phosphat đƣợc thêm đạt vừa đủ 3 ml. Hỗn hợp đƣợc giữ ở nhiệt độ phòng trong 3 phút. Sau đó, đo mật độ quang ở λ = 412 nm. Hàm lượng GSH nM/g được tính theo phương trình hồi quy tuyến tính của chất chuẩn GSH.
2.2.4.6. Phương pháp bơi gắng sức đánh giá sự mệt mỏi [129, 164]
- Nguyên tắc: Thí nghiệm chuột bơi chịu đựng dùng để phát hiện tác dụng an thần và chống trầm cảm, tăng cường sức lực, dựa trên sự phối hợp thần kinh-cơ và bản năng sống sót của động vật. Khi bị stress, khả năng bơi của chuột sẽ giảm đi.
- Cách tiến hành: Chuột được kiểm tra thời gian bơi trước và sau khi tiến hành thí nghiệm. Cân chuột và chuẩn bị các vòng đồng với khối lƣợng/vòng b ng 5% trọng lượng. Vòng đồng được treo vào đuôi chuột, dây treo ngắn hơn đuôi chuột. Nước trong bình đƣợc ổn định ở 25 ± 1 °C và độ sâu 30 cm. Cho chuột vào bình, ghi nhận thời gian bơi, hành vi đứng yên, bất động . Kết thúc thí nghiệm, chuột đƣợc lấy ra khỏi bình và tiếp tục nuôi dƣỡng. Các khoảng thời gian tính từ khi bắt đầu thí nghiệm cho tới khi chuột không nổi đƣợc, bị chìm xuống trong 10s và đƣợc ghi lại máy camera.
- Ch tiêu đánh giá: Quan sát quá trình chuột bơi trong nước và đo thời gian, từ khi bắt đầu thả và tới khi chuột không thể nổi trên mặt nước trong 10s, được gọi là thời gian bơi chịu đựng. Kết quả đƣợc so sánh với nhóm đối chứng.
69
2.2.4.7. Phương pháp test hành vi qua mô hình y-maze để đánh giá hoạt động học tập-trí nhớ [7, 129]
- Nguyên tắc: Y maze là một thử nghiệm hành vi để đo lường trí nhớ ngắn hạn, hoạt động vận động chung của loài gặm nhấm để khám phá môi trường mới. Động vật có xu hướng thay đổi sự lựa chọn cánh trong mê lộ trong các cơ hội liên tiếp. Mê lộ là một dụng cụ hình chữ Y, đƣợc làm b ng tôn, sơn đen, cấu tạo gồm 3 cánh ABC), trong đó ba cánh đối xứng nhau và tách ra ở 1200, chiều dài mỗi cánh 60 cm, rộng 5 cm, cao 10 cm.
- Cách tiến hành: Chuột đƣợc tự do tiếp cận tới ba cánh của mê lộ trong 5 phút.
Trong thời gian đó, tất cả các hành vi của chuột đƣợc ghi lại và phân tích tự động b ng phần mềm Any maze.
- Đánh giá: Hoạt động vận động được đánh giá thông qua quãng đường đi và tổng số lần đi vào các nhánh của mê cung. Số lần đi vào các nhánh tăng so với đối chứng, chứng tỏ sự tăng hoạt động vận động. Thay đổi luân phiên đƣợc định nghĩa là động vật di chuyển vào ba cánh liên tiếp tức là động vật di chuyển theo trình tự ABC, CBA, ACB mà không phải là AAC, CBC. Phần trăm thay đổi luân phiên đánh giá khả năng ghi nhớ của động vật qua các lần đi vào ba nhánh của mê cung. T lệ phần trăm thay đổi luân phiên đƣợc tính theo công thức 7:
% thay đổi luân phiên = × 100 % (7)
2.2.4.8. Phương pháp định tính quercetin trong máu chuột
Mẫu máu chuột được thu thập và tiến hành xử lý mẫu tương tự như xác định quercetin trong mẫu cây thuốc. Sau đó phân tích b ng HPLC. Hàm lƣợng quercetin trong máu chuột đƣợc sắp xếp theo các nhóm ở các mức độ: không phát hiện -), phát hiện mức dưới 1,0 àg/ml được kớ hiệu + , phỏt hiện mức thuộc khoảng từ 1,0 đến 1,6 àg/ml đƣợc kớ hiệu ++ và phỏt hiện ở mức trờn 1,6 àg/ml đƣợc kớ hiệu +++ [114].