Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.3. X Y DỰNG QUY TRÌNH THU NHẬN CHẾ PHẨM QUERCETIN TỪ NỤ HOA HÒE
3.3.3. Áp dụng hai quy trình trên nụ hoa hòe và lá sen để thu nhận chế phẩm quercetin cho nghiên cứu hoạt tính sinh học
Thực hiện theo quy trình với quy mô 60-100g nguyên liệu, trong 2 cây thuốc đƣợc chọn, từ nụ hoa hòe thu đƣợc 2 loại chế phẩm chứa quercetin là từ dịch chiết toàn phần (dạng bán tinh khiết, H1) và từ rutin (dạng tinh khiết, H2). Lá sen ch thu
98
đƣợc một loại từ dịch chiết toàn phần (bán tinh khiết, S). Kết quả xác định một số đặc điểm về vật lý và phổ nghiệm đƣợc thể hiện ở các bảng 3.9.
Bảng 3.9. Một số đặc điểm vật lý của các chế phẩm quercetin thu nhận đƣợc
Mẫu Dạng bề
ngoài
SKBM (Rf, cm)
Nhiệt độ nóng chảy**
Phổ hấp thụ UV-vis***
QC* Bột kết tinh, màu vàng sáng, không mùi, vị đắng
1 vết, Rf là
0,27 ± 0,12 315 ± 2oC
Trong methanol có 2 hấp thụ
cực đại tại bước sóng 258 ± 1 nm
và 370 ± 1 nm QUE* Bột kết tinh, màu
vàng sáng, không mùi, vị đắng
1 vết, Rf là
0,27 ± 0,14 315 ± 3oC
H1
Bột kết tinh, màu vàng đậm, không mùi, vị đắng
2 vết, trong đó có 1 vết
có Rf là 0,27 ± 0,18
314 ± 2oC
H2
Bột kết tinh, màu vàng chanh, không mùi, vị đắng
1 vết, Rf là
0,27 ± 0,11 315 ± 2oC S
Bột kết tinh, màu nâu đỏ, không mùi, vị đắng, chua
3 vết có 1 vết có Rf là 0,27 ± 0,18
313 ± 3oC
Ghi chú: * các mẫu quercetin chuẩn
**của vết có Rf tương đương mẫu chuẩn , được tinh chế bằng SKBM và sau khi làm khan ở 95-97 oC trong 4 giờ
*** của vết có Rf tương đương mẫu chuẩn và được tinh chế bằng SKBM và đo UV-vis
Kết quả ở bảng 3.9, cho thấy các mẫu H1, H2 có màu cảm quan tương đương mẫu chuẩn, còn mẫu S thì khác biệt. Tuy nhiên, cả ba mẫu đều có chất mang đặc điểm tương đương với hai mẫu quercetin chuẩn QC và QUE khi định tính b ng SKBM, nhiệt độ nóng chảy và phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến (UV-Vis). Trong ba mẫu chứa quercetin thu đƣợc từ cây thuốc, khi kiểm tra b ng SKBM, mẫu H2 và mẫu S là phát hiện thấy một vết có Rf tương đương quercetin chuẩn. Trong khi đó, mẫu H1 phát hiện có 2 vết, trong đó có 1 vết có Rf tương đương quercetin chuẩn. Các vết (có Rf tương đương quercetin chuẩn được tinh chế b ng SKBM và cho thấy có nhiệt độ nóng chảy tương đương quercetin chuẩn (bảng 3.9). Các vết tinh chế b ng SKBM được xác định phổ IR [136]. Kết quả thể hiện ở hình 3.16 và bảng 3.10.
Hình ảnh thể hiện trên hình 3.16 cho thấy phổ IR của các vết điều chế thu đƣợc từ các mẫu H1, H2 và S, có hình dạng tương đồng với nhau và tương đương với quercetin chuẩn (QUE, QC).
99
Hình 3.16. Phổ đồ IR của vết điều chế từ mẫu chứa quercetin chiết xuất từ nụ hoa hòe (H1 và H2), lá sen (S) và chất chuẩn quercetin (QC và QUE)
Từ hình 3.16, kết quả giải phổ theo các tần số đặc trương cho cấu trúc của phân tử quercetin, so sánh giữa 3 mẫu điều chế đƣợc (H1, H2 và S) so với hai mẫu chuẩn Qc và Que đƣợc thể hiện trên bảng 3.10.
(QC)
(QUE)
(H1)
(H2)
(S)
Số sóng cm-1)
Độ truyền qua %
100
Bảng 3.10. Giải phổ hồng ngoại (IR) của các mẫu điều chế và quercetin chuẩn Nhóm chức Số sóng v (cm-1) theo phổ IR
Mẫu QC Mẫu QUE Mẫu H1 Mẫu H2 Mẫu S - OH tự do (liên kết hydrogen) 3410,70 3408,95 3415,30 3417,10 3393,60 - OH phenol (liên kết hydrogen) 1382,38 1383,20 1382,31 1384,07 1379,93 C=O aryl keton 1665,73 1667,58 1665,66 1665,57 1666,87 C=C vòng thơm 1610,83
1562,74 1521,80
1612,37 1562,17 1522,51
1611,01 1562,84 1521,77
1612,97 1562,99 1523,68
1611,99 1562,39 1517,19 dao động hóa trị C-O
(C-O stretching vibrations)
1320,63 1319,16 1320,39 1320,69 1318,92
Mặt phẳng uốn (out-of-plane bending bands)
940,23 822,16 722,28 678.05 637,98 601,55
934,32 821,66 722,18 678,80 637,97 601,30
939,98 821,89 721,96 676,31 637,49 600,99
940,06 822,05 722,46 675,87 637,68 601,91
932,24 821,31 722,40 702,53 638,14 600,43 C-O aryl 1261,50 1264,41 1261,09 1264,65 1264,59 C-O phenol 1199,08 1199,55 1198,38 1199,62 1203,12 C-CO-C keton 1169,17 1167,82 1168,74 1168,41 1166,75 Như vậy, kết quả ở bảng 3.10 và hình 3.16 cho thấy các mẫu có phổ IR tương đương nhau và tương đương với quercetin chuẩn, chứng tỏ các vết điều chế đó là quercetin. Hàm lƣợng quercetin trong các mẫu H1, H2 và S tiếp tục đƣợc xác định b ng phương pháp HPLC theo các điều kiện phân tích đã chuẩn hóa. Kết quả phân tích HPLC của các mẫu H1, H2, S cũng nhƣ quercetin chuẩn QC và QUE đƣợc thể hiện trên hình 3.17.
Hình 3.17. Sắc ký đồ HPLC của mẫu chứa quercetin từ nụ hoa hòe (H1 và H2), lá sen (S) và chất chuẩn quercetin (QC và QUE)
Thời gian lưu (phút)
Tín hiệu đáp ứng với DAD (mAU)
101
Kết quả phân tích HPLC cho thấy khi phân tách, nhận diện và xác định tại bước sóng λ = 370 nm các mẫu H2, S và chất chuẩn quercetin (QUE, QC) có 1 đ nh sắc ký và H1 có 2 đ nh sắc ký. Trên sắc ký đồ, đ nh sắc ký thứ nhất của H1 và các đ nh sắc ký duy nhất của H2, S có thời gian lưu tr phút đều không khác biệt so với QUE và QC (giá trị pH1/Qc= 0,998; pH2/Qc = 0,419; pS/Qc= 0,727;pQue/Qc= 0,990 > 0,05 , nghĩa là các chế phẩm H1, H2 và S đều có chứa quercetin với thời gian lưu trung bình khoảng 1,94 phút (hình 3.17).
Đ nh sắc ký thứ hai trong mẫu H1 đƣợc nhận diện cùng với quercetin trong cùng điều kiện, cho thấy hợp chất này có thể có đặc tính hóa học tương đồng với quercetin và thuộc phân nhóm flavonol. Kết quả xác định hàm lượng quercetin b ng đường chuẩn của phương pháp HPLC, thể hiện trên hình 3.18.
Hình 3.18. Hàm lƣợng quercetin trong các chế phẩm phân tích b ng HPLC
Ghi chú: (A) nồng độ quercetin trong mẫu phân tích HPLC; B hàm lƣợng của quercetin;
H1 và H2 chế phẩm từ nụ hoa hòe; S từ lá sen; QC và QUE là quercetin chuẩn
Hình 3.18 cho thấy, hàm lƣợng quercetin ở các mẫu là khác nhau (giá trị pH1/Qc= 0,000; pH2/Qc = 0,001; pS/Qc = 0,000; pQue/Qc = 0,168 < 0,05). Trong đó, lƣợng quercetin (μg/ml) của các mẫu H1, H2, S tương ứng 5,92, 9,0 và 1,09 thấp hơn so với 2 chất chuẩn QUE 9,16 và QC 9,27 hình 3.18A . Hàm lƣợng của quercetin trong chất chuẩn, các mẫu QC, H1, H2, S, QUE được xác định tương ứng 92,72 %; 59,19 %;
90,02 %; 10,85 % và 91,62 % (hình 3.18B).
Quy trình thu nhận trong luận án đã tách đƣợc quercetin từ các cây thuốc tuyển chọn, trong đó các mẫu thu nhận từ hoa hòe có hàm lƣợng quercetin cao hơn khoảng 6 H1 đến 9 lần (H2) mẫu thu nhận từ lá sen (S). Các mẫu thu đƣợc sau loại tạp (H1, H2 và S đều có hàm lượng quercetin tăng lên so với trước loại tạp. Kết quả thu nhận chế phẩm đƣợc thể hiện ở bảng 3.11.
Các mẫu quercetin
Hàm lƣợng quercetin % (B)
Chế phẩm quercetin Nồng độ quercetin trong mẫu phõn tớch HPLC àg/ml)
(A)
102
Bảng 3.11. Các chế phẩm quercetin đƣợc thu nhận từ nụ hoa hòe và lá sen Chế phẩm
quercetin Đặc điểm mẫu Khối
lƣợng thu đƣợc (g)
Hiệu suất thu nhận quercetin
(%)
Bán tinh khiết H1
- Chế phẩm H1 có mức độ tinh khiết về quercetin 59,19 %
- Tiến trình thu nhận:
+ Chế phẩm H1 đƣợc tinh chế b ng SKCK và tủa lạnh từ 19,67 ± 0,24 g cao chiết.
+ Cao chiết đƣợc loại tạp và làm giàu b ng chiết L/L từ 21,83 ± 2,07 g cao chiết thủy phân
+ Cao chiết thủy phân đƣợc thu nhận từ 100 ± 5g bột nguyên liệu nụ hoa hòe (có chứa quercetin trung bình khoảng 15423 mg/100g).
18.21 ±
0,21 g 69,99%
Bán tinh khiết S
- Chế phẩm S có mức độ tinh khiết về quercetin 10,85
%
- Tiến trình thu nhận:
+ Chế phẩm S đƣợc tinh chế b ng SKCK và tủa lạnh từ 24,63 ± 3,28 g cao chiết.
+ Cao chiết đƣợc loại tạp và làm giàu b ng chiết L/L từ 29,83 ± 1,53 g cao chiết thủy phân
+ Cao chiết thủy phân đƣợc thu nhận từ 60 ± 5g bột nguyên liệu lá sen (có chứa quercetin trung bình khoảng 5190,8 mg/100g).
14,04 ±
2,65 48,83%
Tinh khiết H2
- Chế phẩm H2 có mức độ tinh khiết về quercetin 90,02 %
- Tiến trình thu nhận:
+ Chế phẩm S đƣợc tinh chế b ng SKCK và tủa lạnh từ 10,46 ± 2,19 g cao chiết.
+ Cao chiết đƣợc loại tạp và làm giàu b ng chiết L/L từ 12,63 ± 1,95g cao rutin thủy phân
+ Cao rutin thủy phân đƣợc thu nhận từ 100 ± 5g bột nguyên liệu nụ hoa hòe (có chứa quercetin trung bình khoảng 15423 mg/100g).
9,98 ± 2,01 58,25%
Hiệu suất thu nhận quercetin là cao nhất từ nụ hoa hòe (69,99% , sau đó đến thu nhận từ rutin tách từ nụ hoa hòe 58,25% và thấp nhất là từ lá sen (48,83% ). Đối với nụ hoa hòe, trong nghiên cứu của chúng tôi khi tính từ lƣợng chế phẩm quercetin thu đƣợc, quy trình thu nhận quercetin từ dịch chiết toàn phần cho hiệu suất thu nhận cao hơn quy trình thu nhận quercetin từ rutin (hàm lƣợng quercetin 10,78 g so với 8,98 g, p
< 0,05). Chế phẩm H2 có độ sạch khoảng 90% là gần tương đương với chất chuẩn quercetin QUE (91,62 %). Các chế phẩm tương tự H1 và S là chưa được đề cập tron các công trình nghiên cứu trước đây. Các chế phẩm quercetin này tiếp tục được khảo sát hoạt tính sinh học in vitro.
103