Nhóm các phương pháp tách chiết thu nhận hoạt chất

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1. Nhóm các phương pháp tách chiết thu nhận hoạt chất

Trên cơ sở phương pháp OMA 2006.07 được mô tả bởi Nishimuro và cộng sự (2015), nhóm các phương pháp tách chiết thu nhận hoạt chất được tiến hành nối tiếp để thiết lập điều kiện chiết xuất cho thiết lập quy trình thu nhận quercetin từ cây thuốc.

Điều kiện chiết xuất là các thông số về dung môi và thứ tự sử dụng, khối lƣợng nguyên liệu, t lệ nguyên liệu/dung môi cũng nhƣ kĩ thuật, nhiệt độ và thời gian chiết xuất [110, 147, 170, 171]. Các thông số khảo sát: dung môi methanol 72% (MeOH 72%), dung môi MeOH 72% thêm dung dịch HCl 37% đạt 1/10 (v/v) so với tổng thể tích;

thời gian chiết xuất 15, 30, 90 và 120 phút; kĩ thuật đun hồi lưu và siêu âm, có hoặc không kết hợp với kĩ thuật ngâm kiệt.

2.2.1.1. Phương pháp sơ chế, bảo quản và xử lý, loại tạp

Các nguyên liệu sau khi thu hái từ cây thuốc ở dạng tươi được trải mỏng, không xếp đống. Nguyên liệu loại to đƣợc thái phiến, loại nhỏ đƣợc cắt đoạn 3-5 cm và phơi trong bóng râm cho héo dần. Sau phơi khoảng 24h-48h, nguyên liệu cây thuốc đƣợc sấy trong điều kiện áp lực giảm, ở nhiệt độ dưới 40o C cho đến khô và đạt độ ẩm 4- 10% tùy loại. Sau đó tán, xay nguyên liệu thành bột rây qua cỡ rây 0,5-1mm). Bột nguyên liệu đƣợc bảo quản trong các túi thiếc đóng kín, ở nhiệt độ phòng, nơi khô ráo, tránh ánh sáng trực tiếp để dùng cho các nghiên cứu tiếp theo [140, 162].

Các mẫu nguyên liệu gồm toàn cây bỏ rễ , nụ hoa, lá, quả hoặc rễ tương ứng với các cây thuốc, có chứa nhiều thành phần tạp. Các thành phần tạp này đƣợc loại bỏ b ng các dung môi không hòa tan quercetin, rutin. Dung môi thường được lựa chọn cho mục đích này là n-hexan. Cách tiến hành như sau: Các mẫu nguyên liệu tương ứng với các cây thuốc đƣợc sấy khô và nghiền thành bột. Bột nguyên liệu đƣợc ngâm trong n-hexan t lệ 1:15 trong 16 giờ ở nhiệt độ phòng, sau đó tiếp tục ngâm 70 oC trong 30 phút. Dịch chiết được ly tâm, sấy khô b ng tủ sấy chân không dưới 40 oC), thu bột nguyên liệu đã loại tạp [51, 161].

50

2.2.1.2. Phương pháp thu nhận dịch chiết để nghiên cứu hàm lượng quercetin theo kĩ thuật trích ly, hệ dung môi và 10 nguyên liệu cây thuốc

Dịch chiết chứa quercetin được thu nhận theo phương pháp Nishimuro và cộng sự (2015) nhưng tiến hành song song theo hai kĩ thuật đun hồi lưu và siêu âm, áp dụng trên 10 loài cây thuốc khác nhau để đánh giá, lựa chọn [110]. Phương pháp loại tạp đƣợc tiến hành nhƣ sau:

Trước tiên, bột nguyên liệu đã loại tạp được cân chính xác 0,2 g và thêm 12 ml MeOH 72% (t lệ nguyên liệu/dung môi 1:50). Hỗn hợp đƣợc trộn đều và trích ly theo kĩ thuật đun hồi lưu hoặc siêu âm. Nhiệt độ chiết 90 oC ở kĩ thuật đun hồi lưu hoặc 70

oC ở kĩ thuật siêu âm trong bể có tần số sóng siêu âm 37Hz . Tổng thời gian chiết theo 1 chu kỳ là 60 phút và hỗn hợp đƣợc lắc đều sau từng khoảng 15 phút. Dịch chiết với dung môi không có axit ) sau mỗi chu kỳ đƣợc thu lại và lấy mẫu cho phân tích thành phần hóa học và định tính quercetin b ng HPLC. Chu kỳ chiết đƣợc lặp lại cho đến khi chiết hết quercetin.

Tiếp theo, dịch chiết đƣợc bổ sung thêm dung dịch HCl 37% đạt 1/10 v/v so với tổng thể tích và tiếp tục được thủy phân theo kĩ thuật tương ứng. Dịch sau chiết xuất hoặc thủy phân đƣợc lọc b ng giấy lọc, ly tâm 6500 vòng/ phút trong 10 phút.

Dịch nghiên cứu được thu lại, lọc qua màng lọc kích thước 0,45 μm và lấy mẫu cho phân tích thành phần hóa học và HPLC để định tính quercetin. Hệ dung môi thu nhận đƣợc nhiều quercetin hơn, kĩ thuật chiết xuất cho số chu kỳ chiết ít hơn và hàm lƣợng quercetin trong các nguyên liệu đƣợc xác định.

2.2.1.3. Phương pháp nghiên cứu hiệu quả thủy phân của rutin và độ ổn định của quercetin theo thời gian và dung môi chiết xuất

Phương pháp Nishimuro và cộng sự (2015) với điều kiện chiết xuất đã cải tiến thu đƣợc sau mục 2.2.1.2, đƣợc sử dụng để nghiên cứu sự thủy phân của rutin và độ ổn định của quercetin theo thời gian và dung môi. Phương pháp thử nghiệm và đánh giá đƣợc tiến hành nhƣ sau:

Trước tiờn, cỏc dung dịch rutin chuẩn được pha ở nồng độ ban đầu 20 àg/ml trong hệ dung môi tương ứng. Mẫu nghiên cứu được khảo sát theo các thời điểm 15, 30, 60, 90 và 120 phút, sử dụng kĩ thuật lựa chọn với mức thể tích là 12 ml của hệ dung môi MeOH 72% hoặc MeOH 72% chứa HCl 37% (thêm dung dịch HCL 37%

51

đạt 1/10 về thể tích để khảo sát theo kĩ thuật chiết xuất tương ứng đã lựa chọn được.

Các mẫu phân tích đƣợc lọc qua màng lọc 0,45 μm và phân tích quercetin b ng HPLC.

Diện tích đ nh đƣợc ghi lại và đánh giá. Các mẫu nghiên cứu đƣợc tiếp tục xác định hoạt tính chống oxy hóa về khả năng quét gốc tự do, năng lực khử và chống oxy hóa tổng COXH . Hiệu quả thủy phân rutin chuẩn theo dung môi và thời gian đƣợc đánh giá qua hàm lƣợng quercetin và hoạt tính chống oxy hóa in vitro.

Tiếp theo, cỏc dung dịch quercetin chuẩn 10 àg/ml, trong hệ dung mụi khảo sỏt tương ứng, ở mức thể tích là 12 ml được khảo sát ở các thời điểm 15, 30, 60, 90 và 120 phút với điều kiện chiết xuất lựa chọn. Các mẫu nghiên cứu thu nhận tại các thời điểm khảo sát, đƣợc lọc qua màng lọc 0,45 μm và phân tích HPLC. Diện tích đ nh đƣợc ghi lại và đánh giá. Từ kết quả đánh giá, thời gian và dung môi chiết xuất phù hợp đƣợc lựa chọn.

2.2.1.4. Phương pháp nghiên cứu điều kiện trích ly và thu kiệt dịch chiết chứa quercetin, ruitn từ nụ hoa hòe chuẩn

Phương pháp Nishimuro và cộng sự (2015) với điều kiện chiết xuất đã cải tiến và tối ƣu thu đƣợc sau mục 2.2.1.2 cũng nhƣ kết quả đánh giá, lựa chọn sau mục 2.2.1.3, đƣợc sử dụng để nghiên cứu, khảo sát kết hợp với kĩ thuật ngâm kiệt cho thu nhận dịch chiết chứa quercetin và rutin. Điều kiện chiết xuất đƣợc thử nghiệm trên nguyên liệu nụ hoa hòe chuẩn. Phương pháp nghiên cứu, đánh giá được tiến hành như sau:

Bột nụ hoa hòe chuẩn đã loại tạp 10 g được đưa vào hệ dung môi tương ứng và trộn đều. Hỗn hợp đƣợc chiết xuất theo kĩ thuật lựa chọn với các thời gian trích ly đã xác định (nghiên cứu ở các phần trên). Sau các khoảng thời gian thích hợp, dịch chiết đƣợc thu lại sau khi lọc và ly tâm 10 phút ở tốc độ 6500 vòng/ phút. Phần bã nguyên liệu còn lại đƣợc cho vào bình chiết, bổ sung dung môi và nhỏ giọt để thu nhận dịch chiết theo kỹ thuật ngâm kiệt, đến hết quercetin và rutin (kiểm tra b ng sắc ký bản mỏng). Kĩ thuật ngâm kiệt đƣợc thực hiện b ng cách ngâm và nhỏ giọt ở nhiệt độ phòng với tốc độ 2 đến 5 giọt/phút. Thời gian một chu kỳ chiết phụ thuộc vào thể tích bình chứa và độ xốp của nguyên liệu, có giá trị vào khoảng từ 5 đến 60 giờ là đạt hiệu quả. Thời gian ngâm kiệt và lƣợng dung môi sử dụng thực tế đƣợc xác định dựa trên hiệu quả trích ly hết quercetin và rutin có trong nguyên liệu cây thuốc. Xác định lƣợng thể tích dung môi đã sử dụng tương ứng với tổng thời gian ngâm kiệt.

52

2.2.1.5. Phương pháp thu nhận cao chiết trước và sau thủy phân để đánh giá hiệu quả thu nhận quercetin từ 10 nguyên liệu cây thuốc

Phương pháp Nishimuro và cộng sự (2015) với điều kiện chiết xuất đã cải tiến và tối ƣu, theo các thông số đƣợc xác định đƣợc lần lƣợt qua các thí nghiệm từ mục 2.2.1.2 đến mục 2.2.1.4 đƣợc sử dụng để thu nhận cao chiết từ 10 nguyên liệu cây thuốc cho đánh giá hiệu quả thu nhận quercetin. Hiệu quả thu nhận quercetin đƣợc xác định thông qua hàm lƣợng quercetin và hoạt tính chống oxy hóa in vitro của các cao chiết. Với các thông số chiết xuất đã xác định sau mục 2.2.1.4 thể hiện ở phần kết quả tương ứng , phương pháp thu cao chiết chứa quercetin từ 10 nguyên liệu cây thuốc, đƣợc tiến hành nhƣ sau:

Thu nhận cao chiết trước thủy phân: Bột nguyên liệu đã đƣợc xử lý loại tạp, với khối lƣợng 60g (lá sen, lá chùm ngây) và 100g (nụ hoa hòe, cam thảo, đinh lăng, rau đắng biển, rau má, bụp giấm, ngũ vị tử và vỏ hành), đƣợc cho vào bình cầu thủy tinh chịu nhiệt phù hợp với kĩ thuật chiết xuất, sau đó đƣợc bổ sung 500 ml hệ dung môi và trộn đều. Hỗn hợp bột nguyên liệu và dung môi được chiết xuất theo kĩ thuật tương ứng với thời gian trích ly đã xác định (thể hiện ở phần kết quả). Sau khoảng thời gian xác định, dịch chiết đƣợc thu lại sau khi lọc và ly tâm 10 phút ở tốc độ 6500 vòng/

phút. Phần bã nguyên liệu còn lại, tiếp tục đƣợc thu nhận dịch chiết theo kỹ thuật ngâm kiệt với tốc độ nhỏ giọt là 5 giọt/phút theo lƣợng dung môi và thời gian ngấm kiệt đã xác định, định tính kiểm tra lại quercetin trong bã. Các dịch chiết đƣợc gộp lại, lọc, ly tâm, thu hồi dung môi tạo cao chiết dạng lỏng dạng sánh, thể tích cao lỏng thu hồi được xác định theo t lệ 1ml cao lỏng tương ứng với 1g nguyên liệu dùng để chiết xuất . Sau đó, cao lỏng đƣợc chuyển sang cốc thủy tinh chịu nhiệt loại 500 ml và sử dụng tủ sấy áp lực giảm để bốc hơi dung môi ở nhiệt độ dưới 40o C. Sau thời gian 20- 24h bốc hơi áp lực giảm, cao đặc dung môi dùng để chiết xuất còn lại không quá 20%) đƣợc thu lại, chuyển sang cốc thủy tinh chịu nhiệt loại nhỏ hơn 100-150 ml).

Tiếp theo, cao đặc đƣợc tiếp tục sấy áp lực giảm để loại bỏ dung môi, thu cao chiết dạng khô cao khô, độ ẩm còn lại không quá 5% . Cao chiết dạng khô thu nhận từ cây thuốc được bảo quản ở nhiệt độ dưới 4 oC dùng cho phân tích, đánh giá

Thu nhận cao chiết sau thủy phân. Tiến hành tương tự như trên đến phần thu dịch chiết. Dịch chiết sau lọc, ly tâm đƣợc thêm 1/10 (v/v) về thể tích dung dịch HCl

53

37% và tiến hành thủy phân để thu dịch chiết thủy phân. Dịch chiết sau thủy phân đƣợc bốc hơi thu hồi dung môi và sấy khô trong tủ sấy chân không theo cách thức tương tự như trên từ cao lỏng đến cao đặc, kiểm tra đã hết axit và tiếp tục bốc hơi áp lực giảm để thu cao chiết sau thủy phân dạng khô cao khô, độ ẩm còn lại không quá 5%). Cao chiết sau thủy phân dạng khô được bảo quản ở nhiệt độ dưới 4oC dùng cho phân tích, đánh giá.

2.2.1.6. Quy trình thu nhận chế phẩm chứa quercetin từ 1-2 loài cây thuốc để nghiên cứu hoạt tính sinh học

Trên cơ sở kết quả thu đƣợc sau mục 2.2.1.5, cây thuốc sử dụng cho xây dựng quy trình thu nhận chế phẩm quercetin đƣợc lựa chọn. Theo điều kiện chiết xuất đã thử nghiệm trên 10 cây thuốc, quy trình thu nhận đƣợc thiết lập và áp dụng để tạo ra hai loại chế phẩm quercetin, gồm dạng tinh khiết và bán tinh khiết. Tương ứng với hai loại chế phẩm, hai quy trình có sự khác nhau trong giai đoạn chiết xuất thu cao chiết thô nhƣng giống ở điều kiện tinh chế làm giàu tạo chế phẩm chứa quercetin. Quy trình gồm các giai đoạn nhƣ sau:

Trước hết, hai loại cao chiết được thu nhận. Loại cao chiết chứa quercetin được thu nhận trực tiếp 1- 2 loài cây thuốc (có hàm lƣợng quercetin cao và hoạt tính chống oxy hóa mạnh nhất, được lựa chọn từ 10 cây). Điều kiện chiết xuất cải tiến từ phương pháp Nishimuro và cộng sự (2015), với các thông số đã xác định và thử nghiệm sau mục 2.2.1.4 đƣợc sử dụng để thu cao chiết loại này. Bên cạnh đó, loại cao chiết chứa quercetin thủy phân từ rutin tách từ nụ hoa hòe, đƣợc thu nhận trên cơ sở kết hợp thu cao chiết theo điều kiện chiết xuất đã cải tiến sau mục 2.2.1.4 với kết tinh thu rutin theo điều kiện đƣợc mô tả bởi N.T.T. Huyền (2010) cũng nhƣ Paniwnyk và cộng sự (2001) [2, 116]. Theo đó, 100g nụ hoa hòe đƣợc chiết với t lệ nguyên liệu/dung môi là 1:5 sử dụng dung môi MeOH 72% , chiết đến hết rutin kiểm tra b ng sắc ký bản mỏng . Dịch chiết đƣợc lọc loại bã và bay hơi thu cao chiết. Cao chiết đƣợc chiết lại b ng nước nóng t lệ 1:5 với nước, lặp lại 2-3 lần, đun sôi , thu dịch chiết, để lạnh 10

oC, trong 24h , kiểm tra mức độ kết tinh. Kết tinh thu nhận đƣợc sấy khô b ng tủ sấy chân không sau đó đƣợc hòa tan trong methanol, lọc thu dịch và ly tâm 6500 vòng/phút trong 10 phút. Dịch sau ly tâm đƣợc làm bay hơi methanol, thu lấy rutin.

54

Rutin đƣợc sấy khô trong tủ sấy áp lực giảm và hòa tan, thủy phân theo điều kiện chiết xuất đã cải tiến sau mục 2.2.1.4 để thu cao chứa quercetin từ rutin.

Trong giai đoạn tiếp theo, các cao chiết từ 1-2 loài cây thuốc và từ rutin tách từ nụ hoa hòe , được tiếp tục tinh chế để loại tạp và làm giàu quercetin theo phương pháp chiết lỏng/lỏng trong dung môi hữu cơ và loại nhiều lần trong ethanol kết hợp với sắc ký cột chân không, để thu nhận cao chiết giàu quercetin dạng bán tinh khiết và tinh khiết [51]. Quá trình chiết lỏng/lỏng để loại tạp và làm giàu quercetin đƣợc thực hiện như sau: các loại cao chiết đã sấy khô dưới áp lực giảm, được nghiền nhỏ. Bột cao đƣợc cân lấy khoảng 5-10 g cao. Bột sau cân đƣợc cho vào cốc thủy tinh và bổ sung 5- 10 ml dung môi MeOH 72% để hòa tan và lọc nóng. Dịch sau lọc đƣợc cho vào bình chiết loại 50-100ml, lắc đều. Tiếp theo, các dung môi theo thứ tự hexan, methanol, nước, ethyaxetat được bổ sung, theo t lệ tăng dần từ 1:1, 1:2 và 1:6 để loại tạp. Mẫu sau loại tạp đƣợc sấy khô trong tủ sấy chân không và tiếp tục quá trình loại tạp nhiều lần trong ethanol. Quá trình loại tạp nhiều lần trong ethanol đƣợc thực hiện nhƣ sau:

Cao quercetin thô đƣợc hòa tan trong ethanol 70% và ủ ở nhiệt độ 75 oC trong 30 phút.

Phần không tan đƣợc loại bỏ b ng cách lọc và ly tâm 6500 vòng/phút trong 10 phút.

Phần dịch đƣợc sấy khô b ng hút chân không thu quercetin. Quercetin tiếp tục đƣợc hòa tan trong ethanol/H2O 80:20 , lọc và ly tâm thu dịch. Dịch sau ly tâm đƣợc phân tách theo phương pháp sắc ký cột chân không (dùng bơm hút chân không sau cột để tạo chênh lệch áp suất, cho dung môi cũng đi qua cột nhanh hơn). Dịch sau sắc ký cột đƣợc thu lại, ly tâm và bốc hơi trong tủ sấy chân không, thu cao thủy phân gồm cao chiết thủy phân và cao rutin thủy phân đã loại tạp. Cao đã loại tạp chế phẩm chứa quercetin được hòa tan trong ethanol/H2O 80:20 và làm lạnh. Sau đó, nước lạnh loại dùng cho phân tích HPLC đƣợc thêm từ từ vào dung dịch ethanol 80% lạnh có chứa quercetin. Quá trình này đƣợc thực hiện để giảm nồng độ ethanol kéo theo giảm từ từ độ tan của quercetin, đến khi xuất hiện tủa không tan. Phần tủa không tan đƣợc thu lại b ng ly tâm hoặc lọc và sấy khô b ng tủ sấy áp lực giảm đến khối lƣợng không đổi. Các chế phẩm đƣợc xác định khối lƣợng định tính, định lƣợng quercetin b ng SKBM, phổ IR, điểm nóng chảy HPLC. Các chế phẩm này đƣợc đánh giá, so sánh với quercetin chuẩn về hoạt tính sinh học in vitro và in vivo.

55

2.2.2. Nhóm phương pháp định tính, định lượng hợp chất thứ cấp 2.2.2.1. Phương pháp định tính một số nhóm hợp chất thứ cấp

Các mẫu chiết xuất từ cây thuốc lựa chọn đƣợc tiến hành định tính xác định một số nhóm hợp chất theo bảng 2.2 [4].

Bảng 2.2. Các phản ứng định tính hợp chất thứ cấp Nhóm

chất Phản ứng với thuốc thử Quan sát

(phép thử dương tính) Tannin

1 ml dịch chiết + 2 giọt Pb CH3COO)2 10 % Tủa bông

2 ml dịch chiết + 2 giọt FeCl3 5% Xuất hiện màu, tủa xanh đen hoặc xanh nâu nhạt 2 ml dịch thử + 5 giọt dung dịch gelatin 1% Tủa bông trắng

Flavonoid

2 ml dịch chiết + 5 giọt thuốc thử Cyanidin Màu hồng đến đỏ đậm 2 ml dịch chiết + 5 giọt NaOH Màu vàng đậm, đỏ 2 ml giọt dịch chiết, thấm trên giấy + hơi NH3 Đổi màu

2 ml dịch chiết + dung dịch FeCl3 5% + AlCl3 Xanh đen, xanh nâu Alkanoid 2 ml dịch chiết + 5 giọt thuốc thử Mayer Tủa bông trắng

2 ml dịch chiết + 5 giọt thuốc thử Bouchardat Tủa màu đỏ nâu Saponin Tạo bọt trong môi trường kiềm Xuất hiện bọt

2.2.2.2. Phương pháp xác định hàm lượng flavonoid tổng số

Các cây thuốc lựa chọn sẽ đƣợc xác định hàm lƣợng flavonoid tính theo đơn vị quercetin và được tiến hành theo phương pháp mô tả bởi Đái Thị Xuân Trang và cộng sự 2018 cũng nhƣ Bag và cộng sự 2015 [9, 24].

a. Nguyên tắc: Dựa vào phản ứng tạo phức màu của các flavonoid với ion Al3+

trong môi trường kiềm.

b. Cách tiến hành: 1 ml dịch chiết hoặc dung dịch quercetin chuẩn nồng độ từ 0,02 đến 0,2 mg/ml được thêm lần lượt 4 ml nước cất và 0,2 ml dung dịch NaNO2

5%. Sau 5 phút, bổ sung thêm 0,2 ml dung dịch AlCl3 10%, sau 6 phút tiếp tục đƣợc bổ sung 0,2 ml dung dịch NaOH 1M và định mức đến thể tích 5 ml b ng nước cất. Độ hấp thụ quang của dung dịch phản ứng được đo ở bước sóng 510 nm. Quercetin được sử dụng làm chất chuẩn tham khảo.

c. Đánh giá: Xây dựng đường chuẩn độ hấp thụ quang theo dải nồng độ từ 0,02 đến 0,2 mg/ml của quercetin chuẩn. Từ đường chuẩn đó, hàm lượng flavonoid có trong mẫu nghiên cứu tính theo đơn vị quercetin, được xác định từ độ hấp thụ quan tương ứng của các mẫu nghiên cứu.