Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.4. ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CHẾ PHẨM QUERCETIN THU NHẬN
3.4.2. Đánh giá tác động của chế phẩm quercetin từ nụ hoa ho lên hành vi, hoá sinh máu và gan của chuột nhắt trắng ở trạng thái bình thường
3.4.2.1. Kết quả đánh giá độc tính cấp của chế phẩm quercetin từ nụ hoa ho Trong nghiên cứu của chúng tôi, mức liều hiệu quả định hướng (10, 20 mg/kg) và mức liều 250 mg/kg gấp trên 12 lần) được sử dụng qua đường uống. Các triệu
ĐCSH DMSO 0,5% H1 H2 S QUE
107
chứng về dấu hiệu bất thường liên quan đến độc tính cấp trên chuột được quan sát hàng ngày, chú trọng thời điểm 72h và sau 7 ngày. Kết quả thể hiện ở bẳng 3.15.
Bảng 3.15. Kết quả quan sát một số dấu hiệu bất thường của chuột
Kết quả đƣợc thể hiện trên bảng 3.15, cho thấy sau khi sử dụng các mẫu H1, H2 và QUE ở mức liều tương ứng 10 và 20 mg/kg, tất cả chuột đều hoạt động bình thường. Ngược lại, sau 15 phút sử dụng ở mức liều 250 mg/kg, chuột giảm hoạt động, vận động chậm chạp và sau 30 phút chuột biểu hiện mệt, n m cụm lại, ít ăn uống. Tuy nhiên, sau khoảng 1 giờ sử dụng mức liều 250 mg/kg, trên một nửa số chuột bắt đầu ăn uống tốt hơn và linh hoạt trở lại. Sau 2 giờ chuột hoạt động và ăn uống bình thường.
Tiếp tục khảo sát đến 72 giờ không có chuột chết. Theo dõi đến 7 ngày, chuột không chết nhƣng những lô chuột sử dụng mức liều 250 mg/kg đều vận động chậm hơn các nhóm khác, thể hiện tần suất hành vi ra vào khi đánh giá trên thí nghiệm y- maze và hành vi bơi kém hơn xem thêm mục 3.3.5 . Chuột đƣợc mổ khám sau 7 ngày sử dụng, ghi lại hình ảnh đại thể gan chuột, thể hiện trên hình 3.24.
Kết quả quan sát hình ảnh đại thể gan chuột sau 7 ngày cho thấy các lô chuột sử dụng liều thấp 10 và 20 mg/kg, toàn bộ gan có màu đỏ tươi. Hình ảnh gan ở các nhóm này bình thường, nhu mô gan đồng nhất. Túi mật đầy, dịch mật có màu vàng trong, phổi trắng hồng và ruột tiêu hóa tốt không biểu hiện bất thường . Riêng lô chuột sử dụng mức liều 250 mg/kg, gan có dấu hiệu hoại tử và xung huyết. Trong các mẫu chứa quercetin, hai lô chuột sử dụng mẫu H2 và QUE một số cá thể chuột có gan to phù, nhu mô sần sùi không mịn hình 3.24 .
Mẫu Liều (mg/kg)
Số lƣợng chuột chết
Dấu hiệu bất thường khác về hành vi H1
10 0 Không có
20 0 Không có
250 0 Chuột chậm vận động
H2
10 0 Không có
20 0 Không có
250 0 Chuột chậm vận động
QUE
10 0 Không có
20 0 Không có
250 0 Chuột chậm vận động
108
Hình 3.24. Hình ảnh đại thể gan chuột sau 7 ngày dùng mẫu H1, H2 và QUE Nhƣ vậy, kết quả độc tính cấp trong nghiên cứu của chúng tôi tiến hành trên các mẫu H1, H2 và QUE, ở cả ba mức liều 10, 20 và 250 mg/kg, dùng qua đường uống 1 lần/ngày, liên tục trong 7 ngày không thấy chuột chết, không xác định đƣợc giá trị LD50. Tuy nhiên, những chuột sử dụng mức liều 250 mg/kg đã cho thấy các triệu chứng ngộ độc. Sau khi giải phẫu, máu và gan của chuột sử dụng các mẫu H1, H2 và QUE được thu lại để nghiên cứu mức độ ảnh hưởng lên ch số huyết học và hóa sinh sau 7 ngày dùng theo đường uống ở mức liều khác nhau, so sánh với nhóm đối chứng.
Kết quả một số ch số huyết học trong máu chuột đƣợc thể hiện trên bảng 3.16.
Bảng 3.16. Ch số huyết học trong máu chuột ở các lô sử dụng chế phẩm quercetin theo mức liều khác nhau trong 7 ngày
Chỉ số
Đối chứng
Chế phẩm QUE (mg/kg)
Chế phẩm H1 (mg/kg)
Chế phẩm H2 (mg/kg) DMSO
0,5% 10 20 250 10 20 250 10 20 250
( 10WBC 9) / lít
6,94 ± 3,17
6,22
1,8 6,98
2,1 5,43
2,95 6,28
1,93 7,20
2,56 6,65
4,21 6,13
1,91 6,98
2,89 5,87
3,71 RBC
( 1012)/
lít
8,28
±1,44
7,15
1,19 7,84
1,65 6,32
1,31 7,30
1,86 6,52
1,45 6,23 1,61
6,85
1,34 7,52
1,72 6,02
1,59 HGB
(g/dL)
12,84
1,38 14,86
1,23 15,67
1,65 20,32
2,03 15,66
1,87 17,67
1,89 22,31
2,78 15,20
1,29 17,97
1,06 21,67
2,40 Kết quả thu đƣợc cho thấy khi sử dụng ở mức liều 10 và 20 mg/kg, các lô chuột đều có ch số WBC, RBC tương đương với lô đối chứng giá trị pH1/ĐC = 1,000; pH2/ĐC = 1,000; pQUE/ĐC =1,000 > 0,05). Khi ở mức liều 250 mg/kg thì ch số WBC có xu hướng giảm và ch số HGB ở các lô chuột đều tăng so với nhóm đối chứng giá trị pH1/ĐC = 0,000; pH2/ĐC =0,000; pQUE/ĐC =0,000< 0,05). Các ch số hóa sinh liên quan đến nghiên
109
cứu độc tính lên gan, gồm hoạt độ enzym AST và ALT, hàm lƣợng albumin, bilirubin TP và bilirubin TT trong máu đƣợc trình bày ở bảng 3.17. Kết quả đánh giá chức năng thận qua ch số urê và creatinin thể hiện ở bảng 3.18.
Kết quả ở bảng 3.17 cho thấy ở mức liều 10 và 20 mg/kg, các lô chuột sử dụng mẫu H1, H2, QUE đều có ch số AST, ALT tương đương nhau và với nhóm đối chứng giá trị pH1/ĐC = 1,000; pH2/ĐC =1,000; pQUE/ĐC =1,000> 0,05 ). Trong đó, ch số AST, ALT ở các lô sử dụng mẫu H2 và QUE ở mức liều 20 mg/kg có xu hướng cao hơn mức liều 10 mg/kg và đều cao hơn nhóm sử dụng mẫu H1. Ch số AST, ALT của các lô chuột sử dụng H2 và QUE ở mức liều 250 mg/kg đều khác biệt so với lô chuột đối chứng (giá trị pH2/ĐC- AST = 0,000; pH2/ĐC- ALT = 0,003 và pQUE/ĐC- ALT = 0,002; pQUE/ĐC- AST =0,000 <
0,05) cũng nhƣ so với lô chuột sử dụng các mẫu này nhƣng ở mức liều thấp hơn 10 và 20 mg/kg . Riêng mẫu H1 ch có ch số AST là khác biệt so với nhóm đối chứng giá trị pH1/ĐC- ALT= 0,134 > 0,05 và pH1/ĐC- AST= 0,000 < 0,05). So với lô chuột đối chứng, các lô chuột sử dụng mẫu H1, H2 và QUE ở mức liều 250 mg/kg cao hơn lần lƣợt khoảng 18,12%; 36,38% và 46,04% đối với AST và 16,39%, 20,37% và 21,31% đối với ALT).
110
Điều này cũng thể hiện ở ch số albumin xu hướng thấp hơn ; bilirubin TP và bilirubin TT xu hướng cao hơn của lô chuột sử dụng mẫu H1, H2 và QUE ở mức liều 250 mg/kg so với lô chuột đối chứng bảng 3.17 .
Bảng 3.17. Ch số hóa sinh máu liên quan đến chức năng gan, trong các lô chuột sau 7 ngày sử dụng chế phẩm quercetin Chỉ số Đối chứng Chế phẩm QUE (mg/kg) Chế phẩm H1 (mg/kg) Chế phẩm H2 (mg/kg)
DMSO 0,5% 10 20 250 10 20 250 10 20 250
AST
(IU/lít) 173,88 ± 23,64 178,19 ± 23,06 183,31 ± 29,64 253,93 ± 24,97 170,25 ± 17,94
171,81 ±
23,71 205,38 ± 14,12 182,38 ± 14,14 189,44 ± 36,85 237,13 ± 18,95 ALT
(IU/lít) 74,88 13,62 77,03 16,31 78,53 15,23 90,84 13,06 71,38 17,32 79,12 12,29 87,16 13,94 78,44 16,14 80,38 11,18 90,13 11,96 Albumin
(g/L) 29,95 5,69 26,39 4,66 27,62 4,09 21,75 3,83 28,28 4,78 27,49 4,42 25,39 3,47 27,06 4,42 27,50 5,27 21,13 3,53 Bilirubin
TP
(àmol/lit)
10,39 5,49 12,34 3,23 11,31 4,18 17,20 6,32 11,09 4,94 11,22 6,37 18,51 5,69 13,16 6,92 14,43 5,76 19,11 6,72 Bilirubin
TT
(àmol/lit)
11,86 5,33 11,25 3,19 11,23 6,19 19,22 4,34 11,45 3,62 11,97 5,26 17,54 6,74 13,29 6,05 15,23 4,54 20,16 5,71
Theo bảng 3.18, các ch số hóa sinh ở mức liều 10 và 20 mg/kg không khác biệt so với nhóm đối chứng. Chứng tỏ ở mức liều này, các mẫu H1, H2 và QUE không gây độc cho thận. Ngƣợc lại, ở mức liều 250 mg/kg ch số urê và creatinin ở các lô chuột này đều có xu hướng cao hơn lô chuột đối chứng, chứng tỏ các mẫu H1, H2 và QUE ở mức liều cao đã tác động tiêu cực tới thận.
Bảng 3.18. Ch số hóa sinh trong máu liên quan đến chức năng thận, trong các lô chuột sau 7 ngày sử dụng chế phẩm quercetin
Chỉ số Đối chứng Chế phẩm QUE (mg/kg ) Chế phẩm H1 (mg/kg) Chế phẩm H2 (mg/kg)
DMSO 0,5% 10 20 250 10 20 250 10 20 250
Creatinin
(àmol/lit) 50,23 11,86 51,20 12,97 49,40 13,77 71,34 11,87 50,33 19,56 51,22 10,88 61,45 9,86 50,22 12,88 50,63 10,66 72,32 16,27 Ure
(mmol/lit) 7,10 1,86 7,3 1,29 6,98 1,23 7,45 2,01 7,05 1,82 7,54 1,82 7,22 1,76 7,44 1,36 7,55 1,32 7,66 1,97
111
ALT và AST là hai enzym đƣợc tìm thấy chủ yếu ở các tế bào của gan và một số cơ quan khác nhƣ cơ, hồng cầu. Ở trạng thái cơ thể khỏe mạnh, hoạt độ ALT và AST trong máu thấp và sẽ tăng cao khi gan bị tổn thương. Như vậy, kết quả về các ch số hóa sinh đánh giá chức năng gan, thận của chuột nhắt trắng đã cho thấy ở mức liều cao (250 mg/kg sử dụng trong 7 ngày, các mẫu H1, H2 và QUE đã gây độc gan và thận làm gia tăng ch số ALT và AST, nhƣng chƣa gây chết động vật thí nghiệm. Ở mức liều thấp hơn trên 12 lần 10 và 20 mg/kg , các mẫu này chƣa gây tác động tiêu cực tới gan và thận.
3.4.2.2. Kết quả đánh giá hoạt tính chống oxy hoá trên gan chuột
Bên cạnh nghiên cứu về độc tính, hiệu quả chống oxy hóa in vivo ở mức liều 10, 20 và 250 mg/kg của các mẫu H1, H2 và QUE đƣợc chúng tôi đánh giá trên các ch tiêu quan sát là MDA và GSH của gan chuột. Kết quả thể hiện ở bảng 3.19.
Bảng 3.19. Hàm lƣợng MDA và GSH trong gan chuột theo các liều sử dụng chế phẩm quercetin trong điều kiện bình thường
Về giá trị MDA gan, kết quả ở bảng 3.19 cho thấy hàm lƣợng MDA của lô chuột sử dụng các mẫu H1, H2 và QUE ở mức liều 20 mg/kg có xu hướng thấp nhất và cao nhất là ở mức liều 250 mg/kg. So với lô chuột đối chứng, lô chuột sử dụng các mẫu H1, H2 và QUE ở mức liều 250 mg/kg có hàm lƣợng MDA đều khác biệt rõ nét theo xu hướng cao hơn tương ứng là 44,27%, 40,61%, 46,11% (giá trị pH1/ĐC = 0,000; pH2/ĐC = 0,000; pQUE/ĐC =0,000< 0,05). Ở mức liều 10 mg/kg, hàm lƣợng MDA của các lô chuột sử dụng mẫu H1, H2 và QUE cũng có xu hướng cao hơn nhưng ch có lô sử dụng mẫu H2 là thực sự khác biệt so với lô chuột đối chứng. Ngƣợc lại, ở mức liều 20 mg/kg, lô chuột sử dụng các mẫu H1, H2 và QUE hàm lượng MDA có xu hướng thấp hơn so với
Lô chuột Sử dụng Mức liều (mg/kg)
MDA (mM/g mô)
GSH (mM/g mô) Đối chứng DMSO 0,5% 0,2 ml/10g 6,55 ± 1,07 988,72 ± 88,62
Chế phẩm
H1
250 9,45 ± 1,08 729,91 ± 126,32 20 4,29 ± 0,75 1113,75 ± 126,11 10 7,20 ± 0,93 992,88 ± 100,87 H2
250 9,21 ± 1,18 667,69 ± 125,28 20 6,24 ± 1,16 1087,47 ± 257,77 10 7,46 ± 1,03 978,69 ± 100,87 Quercetin
chuẩn QUE
250 9,57 ± 0,98 608,50 ± 142,52 20 5,35 ± 1,08 1105,72 ± 195,10 10 6,78 ± 0.85 985,00 ± 89,08
112
lô chuột đối chứng. Tuy nhiên, trong 3 mẫu sử dụng ở mức liều 20 mg/kg, ch có lô chuột sử dụng mẫu H1 và QUE là thấp hơn rõ nét, tương ứng 34,50%, 18,32% so với lô chuột đối chứng giá trị pH1/ĐC = 0,000 và pQUE/ĐC =0,008< 0,05 còn pH2/ĐC =1,000 >
0,05). Ở mức liều 20 mg/kg, lô chuột sử dụng mẫu H1 có hàm lƣợng MDA là thấp nhất so với hai lô chuột sử dụng H2 và QUE giá trị pH1/H2 = 0,000 và pH1/QUE =0,000<
0,05).
Về giá trị GSH, kết quả thu đƣợc ở bảng 3.19 cho thấy, ở mức liều 250 mg/kg, các lô chuột sử dụng mẫu H1, H2 và QUE đều có hàm lƣợng GSH trong gan thấp hơn lô chuột đối chứng cũng nhƣ thấp hơn so với các mức liều còn lại giá trị pH1/ĐC = 0,000;
pH2/ĐC =0,000; pQUE/ĐC =0,000< 0,05). Ở hai mức liều 10 và 20 mg/kg, ch có lô chuột sử dụng mẫu H1 ở mức liều 10 và 20 mg/kg cũng nhƣ mẫu H2 và QUE ở mức liều 20 mg/kg là có xu hướng gia tăng hàm lượng GSH so với lô chuột đối chứng. Tuy nhiên, ch có lô chuột sử dụng mẫu H1 ở mức liều 20 mg/kg là gia tăng đến mức khác biệt có ý nghĩa thống kê gia tăng khoảng 12,65% so với lô đối chứng ( giá trị pH1/ĐC = 0,005 <
0,05cònpH2/ĐC =0,992; pQUE/ĐC =0,413 > 0,05).
3.4.2.3. ác định dạng tồn tại của quercetin trong gan và máu chuột
Dạng tồn tại của quercetin trong máu chuột đƣợc xác định b ng HPLC. Kết quả thể hiện ở bảng 3.20.
Bảng 3.20. Xác định quercetin trong gan, máu chuột thí nghiệm và thức ăn
Lô chuột Mẫu Liều
(mg/kg)
Quercetin dạng tự do
Quercetin dạng kết hợp
Đối chứng DMSO 0,5% 0,2 ml/10g - -
Chế phẩm
H1
250 + ++
20 - +
10 - +
H2
250 + ++
20 + ++
10 - ++
Quercetin chuẩn QUE
250 ++ ++
20 + ++
10 + ++
Thức ăn Dạng viên hỗn hợp do
Viện Dịch tễ cung cấp - -
Chỳ thớch: - khụng cú quercetin, + quercetin < 1,0 àg/ml, ++ quercetin từ 1,0 đến 1,6 àg/ml;
Kết quả thu đƣợc cho thấy, ngoại trừ lô chuột đối chứng, các lô chuột còn lại đều phát hiện thấy quercetin ở dạng kết hợp. Các lô chuột sử dụng mẫu H1, H2 và QUE ở
113
mức liều 250 mg/kg, mẫu H2 mức liều 20 mg/kg và mẫu QUE mức liều 10 và 20 mg/kg đều phát hiện thấy quercetin ở dạng tự do. Ngƣợc lại, ở mức liều 10 và 20 mg/kg, lô chuột sử dụng mẫu H1 không phát hiện thấy quercetin tự do có trong máu.
Kết quả này là phù hợp với kết quả nghiên cứu về độc tính ở các mức liều nói trên. Kết quả thu đƣợc đã cho thấy r ng khi tiêu thụ quercetin ở liều lƣợng cao các mẫu ở mức liều 250 mg/kg và các mẫu H2 mức liều 20 mg/kg, QUE ở mức liều 10 và 20 mg/kg , khả năng chuyển hóa quercetin đã bị bão hòa, dẫn đến dƣ thừa quercetin tự do trong máu. Sự dƣ thừa này lâu ngày sẽ dẫn đến hoại tử tế bào gan.