Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. XÁC ĐỊNH HÀM LƢỢNG QUERCETIN TRONG 10 LOÀI C Y THUỐC
3.1.2. Thiết lập phương pháp phân tích quercetin bằng HPLC
Trên cơ sở tiếp cận phương pháp HPLC có sử dụng cột sắc ký ZORBAX SB- C18, các thông số về bước sóng, pha động, tốc độ dòng được khảo sát [100, 125]. Giá trị phù hợp của thông số sắc ký đƣợc xác định, dựa trên hình dạng sắc ký đồ và mức độ phân tách đạt yêu cầu với thời gian lưu của đ nh quercetin là ngắn nhất [124]. Về bước sóng, các flavonol hấp thụ cực đại sóng tử ngoại thuộc dải I 320 đến 380 nm) và
75
II 250 đến 285 nm) [86]. Từ dữ liệu tham khảo, mức độ hấp thụ của quercetin ở bước sóng 283, 330, 367, 370 nm thuộc dải I và II, đƣợc khảo sát ở tốc độ dòng 0,5 ml/phút, theo hệ pha động tương tự nghiên cứu của Zu và cộng sự (2006) [9, 125, 175]. Kết quả thể hiện trên hình 3.2
Hình 3.2. Sắc ký đồ đáp ứng tín hiệu của quercetin chuẩn ở các bước sóng khảo sát (hệ pha động tương tự nghiên cứu của Zu và cộng sự (2006) )
Trên hình 3.2 cho thấy, sự hấp thụ của dung dịch quercetin chuẩn, cao nhất ở bước sóng 370 nm và sắc ký đồ thu được có duy nhất một đ nh hấp thụ rõ nét, là tương đồng với nghiên cứu của Thái Duy Thìn và cộng sự [7]. Tuy nhiên, thời gian lưu của quercetin khoảng 19,4 phút (hình 3.2), gấp gần 4 lần so với nghiên cứu của Zu và cộng sự (2006) [175]. Đồng thời, đ nh quercetin có hệ số kéo đuôi b ng 2,42 xác định b ng phần mềm HPLC) không đạt yêu cầu cho định lƣợng [124]. Các kết quả này thể hiện, hệ pha động tham khảo theo nghiên cứu của Zu và cộng sự (2006) đã phân tách đƣợc quercetin nhƣng cần thay đổi về t lệ giữa các dung môi, tốc độ dòng để giảm thời gian lưu cũng như mức độ kéo đuôi. Từ hệ pha động tham khảo (hệ 1, t lệ A/D/C = 0/100/0), kênh C (methanol/axetonitril/H2O/axetic = 40/15/45/1) đƣợc giảm dần và tăng dần kênh A (methanol 100%) và kênh D (acetonitril 100%) để tạo hệ 2 (10/80/10), hệ 3(10/70/30), hệ 4 (15/65/20), hệ 5(10/60/30) và hệ 6 (20/50/30). Các hệ
Thời gian lưu phút
Đáp ứng tín hiệu DAD (mAU)
76
pha động được lựa chọn dựa trên thời gian lưu, hệ số phân tách. Hệ được lựa chọn tiếp tục đƣợc kiểm tra hệ số kéo đuôi. Kết quả thể hiện trên hình 3.3 và 3.4.
Hình 3.3. Thời gian lưu của đ nh quercetin theo các hệ pha động
Kết quả hình 3.3 cho thấy, các hệ pha động (từ hệ 1 đến hệ 6) đều tách đƣợc quercetin với thời gian lưu phút giảm dần, tương ứng là 19,14; 16,81; 12,82; 10,97;
8,88 đến 8,77. Đ nh quercetin theo các hệ đều có thời gian lưu trên 5 phút hình 3.3 . Trong đó, khi giảm dần 10% kênh C, thời gian lưu giảm dần từ hệ 1 đến hệ hệ 5 (p <
0,05). Khi tiếp tục giảm đến 50% kênh C, thời gian lưu giữa hệ hệ 5 và hệ 6 dường nhƣ không khác biệt (hình 3.3). Mức độ phân tách của các đ nh quercetin, khảo sát theo các hệ pha động, đƣợc thể hiện trên hình 3.4.
Hình 3.4. Mức độ phân tách của đ nh quercetin theo các hệ pha động
Kết quả hình 3.4, các hệ pha động (từ hệ 1 đến hệ 6 đều tách đƣợc quercetin ra khỏi rutin với mức độ phân tách có sự phân tán khác nhau, lần lƣợt là 2,53; 4,57; 3,54;
Thời gian lưu phút
Hệ pha động
Hệ pha động
Múc độ phân tách
77
2,46; 1,24 và 0,93, (p < 0,05 , không theo xu hướng giảm dần như thời gian lưu. Trong 6 hệ pha động, ch có 4 hệ (hệ 1 đến hệ 4 đạt yêu cầu. Trong bốn hệ pha động, hệ 2 có mức độ phân tách cao nhất và hệ 4 là thấp nhất. Sắc ký đồ theo hai hệ 1 và 4 đƣợc thể hiện trên hình 3.5.
Hình 3.5. Sắc ký đồ hỗn hợp chất chuẩn (rutin, quercetin) phân tích theo hệ 1 (trên) và hệ 4 dưới
Kết quả sắc ký đồ theo hệ 4 (hình 3.5) cho thấy đ nh sắc ký của đ nh quercetin có sự tách biệt tốt, với hệ số kéo đuôi b ng 1,52 đạt yêu cầu cân đối hơn so với hệ 1.
Tuy nhiên, mặc dù thời gian lưu của quercetin theo hệ 4 10,97 phút, tương đương với mẫu quercetin chuẩn đã giảm đi hơn một nửa so với so với hệ tham khảo (hệ 1, 19,14 phút , nhƣng vẫn còn cao hơn 2 lần so với kết quả đạt đƣợc theo nghiên cứu của Zu và cộng sự 2006 (hệ 1, 5 phút) [175].
Trong định lượng quercetin từ cây thuốc theo phương pháp HPLC, các tốc độ dòng 0,5, 0,7 và 1,0 ml/phút đƣợc sử dụng phổ biến [125, 175]. Khi đó, hệ 4 đƣợc lựa chọn để tiếp tục tăng tốc độ dòng, nh m giảm tiếp tục thời gian lưu của quercetin. Kết quả khảo sát trên hình 3.6 (A và B) cho thấy ở tốc độ 1,0 ml/phút, thời gian lưu
Đáp ứng tín hiệu DAD (mAU)
Thời gian lưu phút) Rutin n
Quercetin (hệ 4)
4)
Thời gian lưu ((phút)
Đáp ứng tín hiệu DAD (mAU)
(hệ 1) 1)
Rutin
Quercetin (hệ 1)
78
quercetin đạt dưới 5 phút (giá trị khoảng 1,94 phút là đạt yêu cầu cho định lượng. Khi đó tốc độ dòng 1,0 ml/phút được lựa chọn là tương đồng với nghiên cứu của Zu và cộng sự (2006) [175].
Hình 3.6. Thay đổi thời gian lưu của đ nh quercetin theo tốc độ dòng (A) và sắc ký đồ thu đƣợc theo tốc độ dòng 1,0 ml/phút (B)
Từ các kết quả thu được, phương pháp HPLC được xác định với điều kiện sắc ký như sau: thể tớch tiờm mẫu 10 àl, bước súng 370 nm, hệ pha động cú t lệ A/C/D = 15/65/20, tốc độ dòng 1,0 ml/phút, phân tách theo cách thức đẳng dòng qua cột ZORBAX SB-C18 (Agilent), nhiệt độ phân tích 25 oC, thời gian phân tích không quá 7 phút/mẫu. Điều kiện sắc ký được đánh giá tính phù hợp theo hướng dẫn của ICH (bảng 3.2).
Theo kết quả thể hiện ở bảng 3.2, độ lặp lại tương đối (RSD) của các thông số sắc ký đều đạt dưới 2%. Đặc biệt RSD của thời gian lưu đạt dưới 1%. Tính đối xứng của đ nh và hệ số kéo đuôi đạt yêu cầu thuộc khoảng 0,8 đến 2,0; hiệu lực tách cột (số đĩa lý thuyết N) có giá trị N > 2500. Phương pháp phân tích có độ chính xác trên 99%, giới hạn phát hiện (LOD) là 0,1 μg/ml và giới hạn định lƣợng LOQ là 0,3 μg/ml. Các
Thời gian lưu phút
Tốc độ dòng ml/phút (A)
Đáp ứng tín hiệu DAD (mAU) (mAU)
Thời gian lưu phút) (B)
79
kết quả này cho thấy điều kiện phân tích HPLC có độ ổn định đạt yêu cầu theo hướng dẫn của ICH về độ lặp lại, độ chính xác và khoảng tuyến tính.
Bảng 3.2. Sự phù hợp của điều kiện sắc ký được đánh giá theo hướng dẫn của ICH Thông số của điều kiện sắc ký Giá trị
trung bình (TB) ± độ lệch chuẩn SD)
Đánh giá
đ nh sắc
ký RSD (%)
Thời gian lưu quercetin chuẩn phút 1,94 ± 0,001 - 0,067 Diện tích đ nh (mAU.S) quercetin
chuẩn (nồng độ 10 àg/ml) 289,76 ± 0,629 - 0,217
Hệ số đối xứng 1,19 ± 0,013 Đạt 1,079
Hệ số kéo đuôi 1,53 ± 0,013 Đạt 0,860
Số đĩa lý thuyết 3158,6 ± 15,39 Đạt 0,487
Độ chính xác 99,47 ± 1,53 - 1,54
Phương trình tương quan tuyến tính giữa diện tích đ nh và nồng độ của quercetin
y = 32,794x -14,292; R2 = 0,9994;
khoảng tuyến tính: 0,5-50 μg/ml;
diện tích đ nh 2,11 - 1625,41mAU.s
- -
Giới hạn phát hiện μg/ml 0,1 - -
Giới hạn định lƣợng μg/ml 0,3 - -
Ghi chú: Độ lặp lại tương đối RSD = (SD/TB)100
Theo bảng 3.2, đường chuẩn biểu diễn mối tương quan giữa diện tích đ nh từ 2,11 đến 1625,41 mAU.s) và nồng độ quercetin chuẩn (từ 0,5 đến 50 μg/ml), có độ tương quan tuyến tính rất chặt (R2 = 0,9994), là phù hợp cho xác định hàm lượng quercetin theo diện tích đ nh khi phân tích b ng HPLC.