Hàm lượng quercetin trong các mẫu nguyên liệu trước khi thu nhận là dữ liệu quan trọng để đánh giá hiệu suất thu nhận quercetin ở các điều kiện chiết xuất khác nhau. Để xác định hàm lƣợng quercetin thì điều kiện phân tích và xử lý mẫu cần đƣợc chuẩn hóa để đảm bảo tính phù hợp cũng như độ tin cậy của phương pháp phân tích HPLC trong các mẫu nguyên liệu khác nhau [132].
Về điều kiện phân tích: Quercetin có tính axít yếu, hiệu quả tách qua cột sắc ký được đảm bảo khi pha động có pH thấp [51]. Hiện nay, xu hướng sử dụng pha động không chứa dung dịch đệm ngày càng gia tăng, để tránh gây mòn hệ thống sắc ký [5].
Trong luận án, hệ pha động theo nghiên cứu của Zu và cộng sự (2006) (chứa methanol, axetonitril, nước, axít axetic và không có đệm được sử dụng để phân tách theo cách thức đẳng dòng qua cột C18 cho định lượng quercetin [175]. Theo hướng dẫn của ICH, sau khi đƣợc tách khỏi cột, đáp ứng tín hiệu DAD của các phân tử quercetin phải có phân bố chuẩn (hình dạng đ nh sắc ký) với độ xiên phù hợp đánh giá qua hệ số kéo đuôi của đ nh sắc ký , để đảm bảo độ tin cậy cho phương pháp định lượng HPLC [132]. Đáp ứng yêu cầu này, đ nh sắc ký thu đƣợc phải có tính đối đối xứng cao, với hệ số kéo đuôi xác định b ng phần mềm HPLC), cần n m trong khoảng giá trị từ 0,8 đến 2,0 [9, 132]. Theo ICH, khi phân tách b ng HPLC, mức độ tách giữa hai đ nh cần
123
có giá trị từ 1,5 trở lên để đảm bảo diện tích hoặc chiều cao của mỗi đ nh có thể đƣợc đo chính xác [132]. Tuy nhiên, nếu mức độ phân tách quá lớn, làm kéo dài thời gian lưu, dẫn đến tiêu tốn dung môi và gia tăng nguy cơ mất đối xứng của đ nh sắc ký. Khi đó, điều kiện sắc ký cho mức độ phân tách đạt yêu cầu với thời gian lưu thấp nhất đƣợc lựa chọn [109]. Trong nghiên cứu của chúng tôi, từ các kết quả thực nghiệm khảo sát và đánh giá về bước sóng, tốc độ dòng và t lệ các thành phần trong hệ pha động tham khảo, phương pháp HPLC được xác định với điều kiện sắc ký như sau: thể tớch tiờm mẫu 10 àl, bước súng 370 nm, hệ pha động cú t lệ A/C/D = 15/65/20, tốc độ dòng 1 ml/phút, phân tách theo cách thức đẳng dòng qua cột ZORBAX SB-C18 (Agilent), nhiệt độ phân tích 25oC, thời gian phân tích không quá 7 phút/mẫu. Tiếp theo, điều kiện sắc ký thiết lập trong nghiên cứu đƣợc đánh giá tính phù hợp để xác định sự chính xác và mức độ tin cậy của phương pháp phân tích. Đánh giá được thực hiện theo hướng dẫn của ICH về thời gian lưu, diện tích đ nh, hệ số kéo đuôi của đ nh (hệ số bất đối xứng), hệ số đối xứng của đ nh, mức độ phân tách, số đĩa lý thuyết, mức độ tuyến tính, độ thu hồi độ chính xác), giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) [132]. Kết quả đánh giá cho thấy phương pháp đảm bảo yêu cầu theo hướng dẫn của ICH, phù hợp cho nghiên cứu định tính, định lượng quercetin trong cây thuốc theo kỹ thuật HPLC. Các thông số sắc ký này để áp dụng cho phân tích quercetin trực tiếp từ dịch chiết cây thuốc là chƣa đƣợc đề cập đầy đủ trong các công trình nghiên cứu trước đây.
Về điều kiện xử lý mẫu: Theo các nghiên cứu đã công bố, kĩ thuật sử dụng để thu nhận rutin và quercetin từ cây thuốc thường sử dụng là đun hổi lưu hoặc siêu âm, được thực hiện theo dung môi chứa ethanol hoặc methanol [51, 157, 170]. Theo báo cáo của Liu (2008), dung môi MeOH với nồng độ khoảng 70%, đƣợc sử dụng phổ biến trong các nghiên cứu về hàm lƣợng và hoạt tính sinh học của hợp chất thứ cấp từ thực vật [95]. Gần đây, theo nghiên cứu của Vetrova và cộng sự 2017 , Dmitrienko và cộng sự 2012 cũng nhƣ Qiao và cộng sự 2014 , hiệu suất thu nhận rutin, quercetin và sự ổn định của quercetin trong dung môi methanol tốt hơn ethanol [51, 125, 157]. Vì vậy, trong nghiên cứu của luận án, trên cơ sở tham khảo phương pháp OMA 2006.07 với điều kiện chiết xuất đƣợc mô tả bởi Nishimuro và cộng sự (2015) kết hợp với kết quả nghiên cứu của Zhao và cộng sự (2019); Zhao và Zhang (2018), điều kiện chiết xuất
124
đã được áp dụng trên các cây thuốc theo kĩ thuật đun hồi lưu hoặc siêu âm với hệ dung môi chứa methanol 72% có hoặc không có axit HCl 37%, để nghiên cứu về hàm lƣợng quercetin và làm cơ sở cho thiết lập quy trình thu nhận chế phẩm quercetin từ các cây thuốc lựa chọn [51, 110, 170, 171].
Chu kỳ chiết là thời gian để chiết hết hoạt chất trong cây thuốc ở điều kiện chiết xuất cụ thể [162]. Điều kiện chiết xuất theo mô tả của Nishimuro và cộng sự (2015) đƣợc thực hiện với thời gian một chu kỳ thực hiện là 60 phút, sử dụng kĩ thuật đun hồi lưu để thủy phân trực tiếp từ 0,2 g bột nguyên liệu thực vật [110]. Theo kết quả nghiên cứu của Dmitrienko và cộng sự (2012), quá trình chiết lỏng/lỏng thường được sử dụng để thu nhận quercetin do thuận lợi hơn cho quá trình tinh chế [51]. Trong nghiên cứu của chúng tôi, điều kiện chiết xuất này đƣợc áp dụng nhƣng có một số thay đổi. Giải pháp lựa chọn của chúng tôi là quá trình thu dịch chiết và thủy phân là tách rời. Khi đó, giai đoạn trích ly thu dịch chiết và thủy phân dịch chiết đƣợc tiến hành theo kĩ thuật đun hồi lưu hoặc siêu âm để khảo sát số chu kỳ chiết, nh m thu nhận được hết quercetin từ các mẫu cây thuốc ở dạng toàn cây bỏ rễ , lá, hoa, quả hoặc vỏ. Từ đó, điều kiện xử lý mẫu phù hợp được lựa chọn để thu dịch chiết tương ứng với từng cây thuốc cho nghiên cứu hàm lƣợng quercetin.
Từ chu kỳ chiết 60 phút , theo điều kiện chiết xuất đƣợc mô tả trong nghiên cứu của Nishimuro và cộng sự (2015), thời gian chiết xuất đƣợc gia tăng để khảo sát, đánh giá hiệu quả chiết xuất chiết hết quercetin theo kĩ thuật, thời gian và hệ dung môi có hoặc không có axit. Kết quả thu đƣợc trong nghiên cứu của chúng tôi cho thấy, trong cả hai kĩ thuật đun hồi lưu và siêu âm, ch có 7/10 mẫu gồm rễ cam thảo, vỏ củ hành tây, đài hoa bụp giấm, rau đắng biển, rau má, quả ngũ vị tử và lá đinh lăng có thời gian chiết là 60 phút 01 chu kỳ , không thay đổi so với điều kiện nghiên cứu theo Nishimuro và cộng sự (2015). Điều đó cho thấy điều kiện chiết xuất theo mô tả của Nishimuro và cộng sự 2015 đã lặp lại đƣợc trên nguyên liệu từ 7 cây thuốc này.
Ngƣợc lại, 3/10 mẫu gồm nụ hoa hòe, lá sen và lá chùm ngây, để chiết hết quercetin, cần tăng thời gian chiết xuất tương ứng với số chu kỳ chiết tăng lên từ 2 đến 2,5 lần.
Dữ liệu này chưa được đề cập trong các nghiên cứu trước đây và có ý nghĩa quan trọng để làm cơ sở hoàn thiện điều kiện chiết xuất của Nishimuro và cộng sự 2015 cho xây
125
dựng quy trình thu nhận chế phẩm quercetin từ cây thuốc có nhiều quercetin là nụ hoa hòe và lá sen.
Về hàm lượng quercetin xác định được trong cây thuốc: Nguyên liệu đƣợc lựa chọn trong nghiên cứu của chúng tôi, phần lớn là từ những cây thuốc đã đƣợc xác định quercetin. Trong đó, nụ hoa hòe ( theo các nghiên cứu trước, tính theo rutin có hàm lƣợng trên 10000 mg/100g), lá chùm ngây (384,6 mg/100g), lá sen (quercetin tự do, 4,3-5,6 mg/100g), vỏ hành tây (348 mg/100g), rau má (0,35-1,09 mg/100g), bụp giấm (0,89 mg/100g) [28, 46, 50, 120, 160] . Một số cây thuốc khác đƣợc định tính có quercetin là rau đắng biển, rễ cam thảo, ngũ vị tử [112, 149, 164]. Riêng lá đinh lăng chƣa có nghiên cứu phát hiện về quercetin. Trong nghiên cứu của chúng tôi, điều kiện phân tích HPLC sau chuẩn hóa cho thấy sự phù hợp để xác định hàm lƣợng quercetin trong các mẫu cây thuốc từ 10 cây thuốc với mức độ pha loãng dịch chiết là từ 50 đến 250 lần. Các cây thuốc đƣợc xác định là có quercetin, nhƣng với mức hàm lƣợng cao hơn các nghiên cứu trước đây đối với 9/10 cây thuốc, ngoại trừ vỏ hành tây [28, 46, 50, 120, 160]. Trong 10 nguyên liệu từ cây thuốc, hoa hòe có hàm lƣợng quercetin cao nhất, sau đó đến sen và chùm ngây. Hàm lƣợng quercetin trong 10 mẫu cây thuốc có sự phân tán rộng, cho thấy việc lựa chọn các cây thuốc là phù hợp cho thử nghiệm, đánh giá về hiệu quả thu nhận cũng nhƣ khả năng tái lặp theo các điều kiện chiết xuất.
Kết quả nghiên cứu chuẩn hóa theo điều kiện chiết xuất tham khảo đã cho thấy số chu kỳ chiết xuất từ các điều kiện chiết tham khảo có sự thay đổi cho phù hợp với hàm lƣợng quercetin trong các cây thuốc [110, 170, 171]. Trong đó, khi hàm lƣợng quercetin gia tăng lên khoảng hơn 10 lần (nhóm nguyên liệu từ 3 cây hòe, sen và chùm ngây so với nhóm 7 cây còn lại) thì số chu kỳ chiết tăng lên hơn 2 lần. Trong đó, hàm lƣợng quercetin trong dịch chiết thủy phân (thêm HCl 37%) cao hơn dịch chiết từ 2 đến hơn 77 lần. Kết quả nghiên cứu trong luận án có khoảng cách khác biệt rộng hơn với kết quả nghiên cứu của Dmitrienko và cộng sự (2012) ch là từ 2 đến 50 lần [51].
Kết quả với hệ dung môi MeOH 72% có bổ sung axit (thêm 1/10 về thể tích dung dịch HCl 37%) và kĩ thuật siêu âm là phù hợp cho trích ly và thủy phân quercetin từ cây thuốc đã lựa chọn cho nghiên cứu hàm lƣợng quercetin. Sau kết quả này, vấn đề nghiên cứu tiếp theo của luận án là giảm thời gian và lƣợng dung môi chiết xuất nh m thu nhận mẫu quercetin từ cây thuốc từ lƣợng bột lớn hơn tăng từ 0,2 g đến 60 g đối
126
với lá sen hoặc 100g đối với nụ hoa hòe) cho thu nhận chế phẩm chứa quercetin để nghiên cứu hoạt tính sinh học.