4.3.1. Đánh giá hoạt tính sinh học in vitro
Quercetin là flavonoid có nhiều trong rau quả, được sử dụng qua đường tiêu hóa.
Vì vậy, trong nghiên cứu của chúng tôi các đích tác dụng về hoạt tính in vitro đƣợc lựa chọn, thuộc hệ thống đường tiêu hóa, nơi tiếp xúc trực tiếp với các hoạt chất có trong chế phẩm dùng theo đường uống ở trạng thái chưa bị chuyển hóa. Theo đó, các chế phẩm quercetin từ nụ hoa hòe và lá sen, đƣợc đánh giá hoạt tính kháng khuẩn, chống oxy hóa và kháng tế bào ung thƣ so sánh với quercetin chuẩn (QUE).
Quercetin có đặc tính khó phân tán trong nước. Vì vậy, dung môi methanol, ethanol hoặc DMSO thường được sử dụng để hòa tan quercetin. Trong các nghiên cứu hoạt tính trên đối tượng sinh học, thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định là phương pháp có thể sử dụng đƣợc cả 3 loại dung môi này [19]. Ngƣợc lại, nghiên cứu hoạt tính sinh học trên dòng tế bào hoặc động vật thực nghiệm, chủ yếu ch sử dụng DMSO [106]. Trong nghiên cứu của chúng tôi, phương pháp đánh giá hoạt tính kháng khuẩn đƣợc áp dụng theo hai dung môi methanol và DMSO. Kết quả thu đƣợc cho thấy, các mẫu thu nhận từ dịch chiết toàn phần và rutin nụ hoa hòe (H1, H2), dịch chiết toàn phần lá sen S đều có hoạt tính kháng khuẩn. Tuy nhiên, hoạt tính kháng khuẩn phụ thuộc nhiều vào dung môi hòa tan. Hoạt tính kháng khuẩn của các mẫu khi đƣợc hòa tan trong methanol MeOH cao hơn so khi trong DMSO 0,5%. Do đó, dung môi MeOH đƣợc sử dụng để nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa in vitro và dung môi DMSO đƣợc sử dụng để nghiên cứu hoạt tính kháng tế bào ung thƣ đại trực tràng HCT116.
Các nghiên cứu dịch tễ cho thấy việc tiêu thụ thực phẩm giàu flavonoid nhƣ rau, trái cây, trà có thể giảm nguy cơ mắc bệnh ung thƣ, trong đó có ung thƣ đại trực tràng [35]. Trong nghiên cứu của chúng tôi, các mẫu đƣợc khảo sát và đánh giá hoạt tính kháng tế bào ung thƣ HCT116, thông qua t lệ giảm tế bào sống. Hầu hết các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của quercetin mới ch đƣợc thực hiện trên quercetin chuẩn, với độ tinh sạch cao [17]. Trong luận án, hoạt tính chống oxy hóa, kháng khuẩn và kháng tế bào ung thƣ, đánh giá trên các chế phẩm quercetin đƣợc thu nhận từ nụ hoa
130
hoè, lá sen ở các mức độ tinh khiết khác nhau là kết quả nghiên cứu mới, chƣa đƣợc công bố.
Theo các nghiên cứu đã thực hiện trước đây, hoạt tính kháng tế bào ung thư của quercetin chuẩn đƣợc thực hiện ở nồng độ dao động từ 25 μM đến 200 àM [72]. Kết quả nghiên cứu của luận án cho thấy giá trị IC50 của mẫu chuẩn QUE tương đương 62,67 àM, chứng tỏ mẫu QUE cú hoạt tớnh khỏng tế bào ung thƣ đại trực tràng HCT116. Trong các mẫu nghiên cứu, mẫu H1 có hoạt tính cao nhất và cao hơn chất chuẩn QUE. Quercetin và kaempferol là hai flavonol phổ biến nhất trong rau, quả [45].
Trong cây thuốc thường có chứa đồng thời quercetin và kaempferol [35, 103].
Carmona và cộng sự đánh giá tác dụng hiệp đồng trên tế bào ung thƣ đại trực tràng HCT116 cho thấy khi kết hợp quercetin với kaempferol, hiệu quả kháng tế bào ung thƣ HCT116 cao hơn khi sử dụng đơn lẻ [35]. Sắc ký đồ mẫu H1 có thêm một đ nh sau quercetin chứng tỏ trong mẫu có thêm chất khác, có thể là kaempferol. Chế phẩm H1 mặc dù có hàm lƣợng quercetin thấp hơn nhƣng lại có hoạt tính sinh học cao hơn chế phẩm H2 và mẫu chuẩn QUE. Nguyên nhân của hiện tƣợng này có thể là do chất khác có trong chế phẩm H1 (có thể là kaempferol) đã hiệp đồng tác dụng với quercetin, nên hoạt tính chống oxy hóa và kháng tế bào cao hơn chế phẩm H2 và mẫu chuẩn QUE.
Nghiên cứu hoạt tính in vitro, mối tương quan giữa nồng độ và tác dụng của các chế phẩm H1, H2 và quercetin chuẩn QUE đã đƣợc kiểm chứng trên các đích tác dụng đó là tế bào vi khuẩn, tế bào ung thƣ trực tràng. Kết quả các chế phẩm H1, H2 và QUE đều có hoạt tính đối với các đích tác dụng nói trên, trong đó chế phẩm H1 mặc dù hàm lƣợng quercetin thấp nhất nhƣng cho hoạt tính cao nhất. Những dữ liệu về hoạt tính sinh học in vitro của các chế phẩm H1, H2 và S, thu nhận đƣợc theo hai quy trình, là đóng góp mới của luận án.
4.3.2. Đánh giá hoạt tính sinh học in vivo
Chúng tôi định hướng ứng dụng chế phẩm quercetin để hoàn thiện bữa ăn, theo hướng tăng cường hàm lượng quercetin trong khẩu phần ăn hàng ngày cho các đối tượng bị bệnh mạn tính tiểu đường, ung thư , những người lao động nghề nghiệp đặc thù trong điều kiện khắc nghiệt quân nhân, vận động viên hoặc hỗ trợ giảm độc tính của thuốc hóa dƣợc trong điều trị. Theo nghiên cứu của Yao và cộng sự (2018), lƣợng quercetin tiêu thụ hàng ngày từ rau, quả trung bình khoảng 20,9 ± 2,32 mg/day [167].
131
Vì vậy, trong luận án mức liều 10 mg/kg và 20 mg/kg đƣợc lựa chọn cho nghiên cứu hiệu quả chống oxy hóa in vivo.
- Đánh giá trên chuột ở trạng thái bình thường
Trong nghiên cứu luận án, mô hình chuột nhắt trắng ở trạng thái bình thường, chuột sử dụng paracetamol hoặc sốc nhiệt đƣợc thiết lập và sử dụng cho nghiên cứu hoạt tính sinh học in vivo của các chế phẩm chứa quercetin từ nụ hoa hỏe H1, H2 , so sánh với quercetin chuẩn QUE . Các chế phẩm H1, H2 và QUE đƣợc hòa tan vào DMSO và sau đó phân tán vào nước DMSO 0,5% , dùng qua đường uống để nghiên cứu về độc tính cấp, khả năng chống oxy hóa, khả năng cải thiện thời gian bơi, trí nhớ.
Theo các nghiên cứu đã thực hiện, khi dùng qua đường uống, quercetin cũng như các hợp chất thứ cấp khác, tương tác với cơ thể động vật theo nhiều đích khác nhau trên con đường chuyển hóa xenobiotic. Khi đó, cơ thể động vật chịu tác động đồng thời của quercetin ở dạng tự do quercetin aglycon cũng nhƣ dạng chuyển hóa quercetin kết hợp [51]. Nghiên cứu của luận án lựa chọn gan, thận và máu là các cơ quan và tổ chức liên quan đến chuyển hóa xenobiotic, để đánh giá mức độ ảnh hưởng của các chế phẩm H1, H2 và QUE lên các ch số hóa sinh, huyết học của chuột.
Khi sử dụng quercetin và các hợp chất thứ cấp không tan trong nước ở mức liều cao, thời gian dài sẽ có tác dụng độc tính, làm tiêu tốn các chất liên hợp nội sinh giảm GSH , gia tăng quá trình peroxy hóa lipid gia tăng MDA , gây hoại tử tế bào gan và giải phóng các enzym ch thị AST và ALT) vào trong máu [1, 20, 185]. Mức liều hiệu quả trong nghiên cứu dược lý cần thuộc phạm vi an toàn, dưới ngưỡng gây độc. Phạm vi an toàn của mẫu được xác định dựa trên nghiên cứu về độc tính, trước hết là độc tính cấp. Độc tính cấp là tác dụng có thể gây chết động vật thí nghiệm, sử dụng liều thử ở mức 10-12 lần mức liều nghiên cứu hiệu quả dƣợc lý [13]. Trong luận án, kết quả khảo sát được thực hiện qua đường uống ở ba mức liều, gồm hai mức liều thấp 10, 20 mg/kg và mức liều cao 250 mg/kg, gấp trên 12 lần , sử dụng liên tục trong 7 ngày để đánh giá hiệu quả của các mẫu dưới sự chịu sự chi phối đồng thời của hoạt tính anti-oxidant (hoạt tính chống oxy hóa, giảm MDA và gian tăng GSH cũng nhƣ hoạt tính pro-oxidant (tiền chất oxy hóa, gây hoại tử gan, gia tăng hoạt độ enzym ALT và AST trong máu). Kết quả nghiên cứu thu đƣợc cho thấy, tất cả các chế phẩm chứa quercetin H1, H2 và QUE ở mức liều 10 và 20 mg/kg đều không gây tác động tiêu
132
cực tới gan và có hiệu quả chống oxy hóa. Ngƣợc lại, mức liều 250 mg/kg vừa có hiệu quả chống oxy hóa nhƣng lại gây độc cho gan. Tuy nhiên, mức liều 250 mg/kg không gây chết chuột sau 7 ngày sử dụng. Kết quả nghiên cứu về độc tính cấp của chúng tôi trên mẫu quercetin chuẩn QUE ở mức liều 250 mg/kg, không xác định đƣợc LD50 là khác biệt với công bố của Sullivan và cộng sự (1951), khi tác giả này xác định đƣợc mức liều gây chết 50% LD50 của quercetin chuẩn là 160 mg/kg [66]. Tuy nhiên, kết quả nghiên cứu luận án là tương đồng với báo cáo của Harwood và cộng sự 2007 , cho thấy r ng không lặp lại đƣợc liều LD50 của Sullivan và cộng sự (1951) khi nghiên cứu độc tính cấp của quercetin chuẩn trên chuột nhắt trắng [66].
Từ kết quả nghiên cứu độc tính thu đƣợc, cho thấy tác động của quercetin là không thực sự ổn định. Nguyên nhân có thể do sự biến động về khả năng sinh khả dụng khi dùng qua đường uống, nên lượng quercetin được hấp thu vào máu trong các nghiên cứu là không giống nhau, do đó tác động độc tính của quercetin lên động vật là khác nhau. Kết quả kiểm tra nồng độ quercetin dạng tự do và dạng kết hợp có trong máu chuột theo các mức liều sử dụng của các chế phẩm H1, H2 và QUE trong nghiên cứu đã góp phần minh chứng cho điều này. Kết quả đánh giá đã cho thấy quercetin khi vào trong cơ thể chuột ở liều thấp 10 và 20 mg/kg , đƣợc hấp thu và chuyển hóa trong giới hạn cho phép của cơ thể động vật, nên đƣợc chuyển hóa thành các dẫn xuất của quercetin. Ngƣợc lại, mức liều 250 mg/kg của quercetin đã vƣợt quá ngƣỡng chuyển hóa của gan nên quá trình chuyển hóa bị bão hòa và quercetin đƣợc hấp thu vào trong máu nhiều hơn hai mức liều còn lại. Từ đó, lƣợng quercetin tự do cũng tăng lên. Điều này góp phần giải thích nguyên nhân gây tổn thương gan của mức liều 250 mg/kg như thể hiện ở các kết quả đã nêu. Bên cạnh đó, trong nghiên cứu của luận án, kết quả cũng cho thấy nồng độ quercetin trong máu chuột của các mẫu ở mức liều 250 mg/kg là cao nhất so với cỏc mức liều cũn lại, nhưng khụng vượt quỏ 1,6 àg/ml. Kết quả này tương đồng với giá trị nồng độ tối đa Cmax trong máu của quercetin 1,127 ± 0,329 mg/l) đƣợc Ou-yang và cộng sự 2013 ghi nhận khi nghiên cứu về dƣợc động học dùng qua đường uống trên chuột [114]. Đồng thời, trong nghiên cứu của luận án, kết quả về độc tính và dạng tồn tại của quercetin trong máu chuột cũng cho thấy chế phẩm loại H1 có tác động bất lợi tới gan là thấp hơn các chế phẩm H2 và QUE.
133
Gan là nơi có hoạt động trao đổi chất cao và quan trọng, thường sinh ra các gốc tự do, có nguy cơ dẫn đến tình trạng stress oxy hóa khi bị nhiễm độc [90]. Stress oxy hóa làm suy giảm các chất chống oxy hóa nội sinh nhƣ superoxide dismutase SOD , catalase CAT , glutathione reductase GSH và tăng sự peroxide hóa lipid LPO trong gan. Sử dụng chất chống oxy hoá ngoại sinh là một cách hợp lý để phòng ngừa và điều trị các bệnh về gan liên quan đến stress oxy hóa [92, 145]. Chất chống oxy hóa tự nhiên chứa trong các cây thuốc thường có khả năng chống oxy hóa và làm sạch gốc tự do cũng nhƣ tác dụng chống viêm. Trong nghiên cứu của chúng tôi, ch số MDA và GSH đƣợc sử dụng để đánh giá tiềm năng về hoạt tính chống oxy hóa in vivo của các chế phẩm chứa quercetin [90].
Hàm lƣợng MDA càng thấp chứng tỏ mẫu có khả năng chống peoxy hóa lipid tốt hơn [90]. Trong nghiên cứu của luận án, tất cả các nhóm chuột ở trạng thái bình thường có sử dụng chế phẩm quercetin thu nhận được từ nụ hoa hòe H1, H2 ở mức liều 20 mg/kg cho hiệu quả giảm lƣợng MDA tốt hơn mức liều 10 mg/kg. Nghiên cứu của chúng tôi tương ứng với kết quả của Haleagrahara và cộng sự (2009) về hiệu quả cải thiện tình trạng stress oxy hóa của quercetin theo các mức liều khác nhau, trên mô hình chuột bơi cƣỡng bức [65]. Tuy nhiên, nghiên cứu của Haleagrahara và cộng sự (2009) chƣa thực hiện trên chế phẩm quercetin thu nhận từ nụ hoa hòe. Kết quả nghiên cứu theo luận án cho thấy, các nhóm chuột sử dụng chế phẩm quercetin loại H1, H2 và QUE ở mức liều 20 mg/kg và các chế phẩm loại H1 mức liều 10 và 20 mg/kg có hàm lƣợng MDA thấp nhất, chứng tỏ mẫu loại H1 có khả năng hạn chế peroxy hóa lipid trên chuột nhắt trắng là hiệu quả hơn 2 chế phẩm H2 và QUE.
Glutathion GSH là nhóm thiol nội bào phổ biến nhất, với nồng độ nội bào từ khoảng 500 đến 10.000 nmol. Ở dạng khử, GSH là một chất chống oxy hoá đóng vai trò quan trọng trong bảo vệ tế bào khỏi tác hại của gốc tự do, làm giảm chất oxy hóa nội sinh và chống stress oxy hoá ngoại sinh. Ở các nhóm chuột bình thường và sử dụng các chế phẩm ở mức liều 10 và 20 mg/kg, hàm lƣợng GSH của gan chuột ở các nhóm sử dụng mẫu H1 cao hơn QUE và đều cao hơn H2. Ch số GSH càng tăng chứng tỏ sản phẩm có tác dụng chống oxy hóa. Kết quả này là phù hợp với báo cáo của Subramanya và cộng sự (2018), về hiệu quả cải thiện của chế phẩm từ cây thuốc lên tình trạng suy giảm GSH trong stress oxy hóa do paracetamol liều cao [145]. Tuy
134
nhiên, nghiên cứu của Subramanya và cộng sự (2018) chƣa thực hiện trên chế phẩm quercetin. Trong nghiên cứu của chúng tôi ở mức liều 20 mg/kg, chế phẩm chứa quercetin loại H1 cho hiệu quả gia tăng hàm lƣợng GSH tốt nhất so với các mẫu loại H2 và QUE.
Ch số MDA và GSH của chuột trong các nhóm sử dụng chế phẩm H1, H2 và QUE ở mức liều 250 mg/kg trong 7 ngày có sự khác biệt so với nhóm đối chứng theo chiều hướng gia tăng MDA và giảm GSH, chứng tỏ gan đã bị tổn thương [80]. Điều này cho thấy khi sử dụng các mẫu H1, H2 và QUE ở mức liều cao trong thời gian dài ngày, hàm lượng quercetin có ảnh hưởng bất lợi đến gan chuột khi đánh giá về ch số enzym AST, ALT, MDA và GSH. Kết quả luận án tương đồng với báo cáo của Harwood và cộng sự (2007), cho thấy quercetin là chất thải trừ qua gan nên nếu dùng liều cao dài ngày sẽ làm suy kiệt các chất khử độc nội sinh, gây hoại tử gan [66].
Nhƣ vậy, trong luận án, các kết quả nghiên cứu trên chuột nhắt trắng ở trạng thái bình thường cho thấy các mẫu H1, H2 và QUE đều có tác dụng kích thích gia tăng hàm lƣợng GSH và giảm lƣợng MDA của gan chuột. Trong đó, ở tất cả các mẫu nghiên cứu H1, H2 và QUE , mức liều 20 mg/kg cho hiệu quả tốt hơn các mức liều còn lại. Ở cùng mức liều 20 mg/kg, mẫu H1 ít gây tác động tiêu cực tới gan, hiệu quả gia tăng GSH và giảm MDA tốt hơn so với mẫu H2 và mẫu QUE quercetin chuẩn . Cho đến nay các nghiên cứu tương tự mới ch được thực hiện trên quercetin chuẩn.
Nghiên cứu đánh giá độc tính và hoạt tính chống oxy hóa in vivo trên chuột nhắt trắng ở trạng thái bình thường của các chế phẩm quercetin tinh khiết H2 và bán tinh khiết H1 thu nhận từ nụ hoa ho của Việt Nam cho thấy, chế phẩm loại H1 có hiệu quả hơn quercetin chuẩn QUE , là kết quả đóng góp mới của luận án.
- Đánh giá trên chuột ở trạng thái sốc nhiệt
Các kết quả nghiên cứu về ch số hóa sinh của các nhóm chuột sử dụng chế phẩm chứa quercetin H1, H2 và QUE ở mức liều 20 mg/kg, trong 7 ngày cho thấy có chiều hướng diễn biến tốt hơn so với nhóm không sử dụng. Điều đó chứng tỏ các chế phẩm chứa quercetin trong nghiên cứu của luận án có khả năng ứng dụng trong lĩnh vực y học dự phòng. Sốc nhiệt heat stroke được báo cáo ảnh hưởng hầu hết đến các cơ quan trong cơ thể, với những rối loạn chức năng sinh lý có thể dẫn đến các bệnh mạn tính như tim mạch, ung thư và đái tháo đường [107]. Theo báo cáo của Xu và cộng sự
135
(2019), tác dụng chống oxy hóa của quercetin đóng vai trò quan trọng trong dự phòng và điều trị các bệnh mạn tính nói trên [166]. Với mục tiêu khảo sát khả năng dự phòng trong điều kiện cơ thể bị stress oxy hóa do nhiệt, các lô chuột sử dụng chế phẩm chứa quercetin H1, H2, QUE, mức liều 20 mg/kg sau 7 ngày tiếp tục đƣợc đánh giá hiệu quả bảo vệ gan trong điều kiện chuột bị sốc nhiệt theo mô hình cấp tính hoặc mạn tính.
Nhiệt độ là yếu tố vật lý tác động thường xuyên và lặp lại lên cơ thể, đặc biệt là những người hoạt động trong điều kiện khắc nghiệt như người lính và vận động viên thể dục thể thao. Viêm và stress oxy hóa đƣợc ghi nhận là những nguyên nhân gây tổn thương gan trong điều kiện sốc nhiệt [38, 58]. Nhiệt độ cao đã được ghi nhận làm tăng sản xuất gốc tự do dẫn đến gia tăng MDA và giảm hoạt động chống oxy hóa nội sinh trong các mô khác nhau, đặc biệt là mô gan [60, 58]. Báo cáo của Garcin và cộng sự (2008), có hai trường hợp gây suy gan cấp tính liên quan đến sốc nhiệt đó là do gắng sức chạy marathon và do làm việc trong môi trường có nhiệt độ cao [58]. Cho đến nay, nghiên cứu ứng dụng hợp chất thứ cấp từ cây thuốc trong cải thiện tình trạng stress oxy hóa do sốc nhiệt đã đƣợc chú trọng nghiên cứu. Hiệu quả bảo vệ gan theo hướng chống oxy hóa, trong điều kiện sốc nhiệt mạn tính của quercetin đã được chứng minh, nhƣng chủ yếu thực hiện trên quercetin chuẩn có mức độ tinh khiết cao [38].
Gần đây, sử dụng sản phẩm chiết xuất từ cây thuốc để cải thiện tình trạng stress oxy hóa cũng nhƣ hành vi của chuột đã đƣợc nghiên cứu [60, 107]. Tuy nhiên, nghiên cứu theo hướng này trên các chế phẩm chứa quercetin từ nụ hoa hòe chưa được đề cập.
Về mô hình thử nghiệm: Trong nghiên cứu luận án, mô hình sốc nhiệt mạn tính cũng nhƣ cấp tính đƣợc khảo sát theo điều kiện đã đƣợc mô tả của Chen và cộng sự (2014) hoặc Abdelnasir và cộng sự (2014) [14, 38]. Trong đó, điều kiện sốc nhiệt mạn tính được thực hiện theo phương pháp của Chen và cộng sự (2014), tiến hành liên tục trong 7 ngày [38]. Tuy nhiên, điều kiện thử nghiệm này trong nghiên cứu của chúng tôi chƣa có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa lô chuột bị sốc nhiệt và lô chuột đối chứng về hoạt độ hai enzym AST, ALT trong máu chuột nghiên cứu. Ngƣợc lại, điều kiện sốc nhiệt cấp tính được thực hiện theo phương pháp của Abdelnasir và cộng sự (2014) đã có sự khác biệt giữa giữa hai lô chuột này [14]. Theo đó, sau 1 lần sốc nhiệt cấp tính, nhóm chuột sốc nhiệt đã bị tổn thương gan, thể hiện hoạt độ enzym đã gia tăng hơn nhóm đối chứng. Kết quả thu đƣợc của chúng tôi là phù hợp với nghiên cứu