Sơ đồ và diễn giải cách tiếp cận giải quyết mục tiêu nghiên cứu

2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.5. Sơ đồ và diễn giải cách tiếp cận giải quyết mục tiêu nghiên cứu

Hàm lƣợng quercetin trong cây thuốc đƣợc nghiên cứu theo sơ đồ đƣợc thể hiện trên hình 2.1. Theo đó, quercetin đƣợc xác định trực tiếp từ dịch thu phân nguyên liệu 10 loài cõy thuốc b ng HPLC: cột pha đảo ORBAX SB-C18, 4,6  150 mm, 5 àm. ỏp

70

suất cột thay đổi từ 0 đến 400 bar; nhiệt độ 25oC, thể tớch tiờm mẫu 10àl, thời gian phân tích < 25 phút/lần [79, 170], diode array detector DAD ”. Điều kiện đƣợc khảo sát, tối ưu về bước sóng, pha động và tốc độ dòng. Sự phù hợp của phương pháp được đánh giá theo hướng dẫn của ICH về thời gian lưu, diện tích đ nh, hệ số kéo đuôi, hệ số đối xứng, mức độ phân tách, số đĩa lý thuyết, mức độ tuyến tính, độ thu hồi, giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lƣợng (LOQ). Hàm lƣợng quercetin đƣợc xác định b ng đường chuẩn [152, 175].

Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu tách chiết, xác định hàm lƣợng quercetin trực tiếp từ dịch chiết nguyên liệu cây thuốc b ng HPLC

Ch thích: hình chữ nhật chứa đựng các dữ liệu viền liền là từ tham khảo, viền n t rời là thu được từ thực nghiệm, viền liền đậm là cho các nghiên cứu tiếp theo ; hình elip biểu thị cho các thực nghiệm cần tiến hành viền liền là phân tích, đánh giá; viền n t rời là thực nghiệm, khảo sát ; các nội dung biểu di n không có đường viền bao quanh biểu thị các đối tượng sử dụng để thực nghiệm.

Chu kỳ chiết đƣợc thử nghiệm bắt đầu với 60 phút, t lệ nguyên liệu/dung môi 1:50, trích ly trong MeOH 72% để thu dịch chiết và thêm 1/10 v/v về thể tích dung dịch HCl 37% để thủy phân. Điều kiện khảo sát, lựa chọn là i đun hồi lưu ở 90 oC hoặc siêu âm trong bể ở 37 kHz ở 70oC; (ii) dung môi là MeOH 72% có hoặc không có HCl [110, 171]. Từ đó, chu kỳ chiết xuất đƣợc tăng dần để xác định điều kiện chiết xuất quercetin phù hợp với từng cây thuốc.

2.2.5.2. Xây dựng quy trình thu nhận chế phẩm quercetin từ cây thuốc

Tiến trình nghiên cứu để xây dựng quy trình thu nhận chế phẩm quercetin từ cây thuốc đƣợc thể hiện trên hình 2.2. Theo đó, các thông số chiết xuất đƣợc xác lập để khảo sát và lựa chọn. Quá trình trích ly và thủy phân đƣợc thực hiện tách rời với kĩ

Phương pháp phân tích HPLC

Hàm lƣợng quercetin có trong cây thuốc

Định lƣợng Thu nhận chế

phẩm 10 dịch

chiết

Điều kiện chiết xuất theo cây thuốc Số chu kỳ

chiêt theo cây thuốc 0,2 g nguyên liệu

từ cây thuốc

Chuẩn hoá

Chu kỳ và kĩ thuật chiết xuất

Quercetin Điều kiện phân

tích HPLC Điều kiện thu nhận dịch chiết

Dữ liệu tham khảo

71

thuật đun hồi lưu hoặc siêu âm kết hợp với ngâm kiệt. Điều kiện chiết xuất về dung môi, kĩ thuật và thời gian đƣợc lựa chọn từ nghiên cứu sự ổn định của quercetin chuẩn, hiệu quả thu nhận quercetin từ rutin chuẩn, khả năng trích ly và hiệu quả thu nhận quercetin từ nụ hoa hòe chuẩn cũng nhƣ từ nguyên liệu cây thuốc [110, 147, 170, 171].

Từ đó, quy trình thu nhận chế phẩm quercetin từ cây thuốc đƣợc thiết lập hình 2.2 .

Hình 2.2. Sơ đồ nghiên cứu quy trình thu nhận chế phẩm quercetin từ cây thuốc

Ch thích: hình chữ nhật chứa đựng các dữ liệu viền liền n t nhạt là từ kết quả của mục 2.2.1.2, viền n t rời là thu được từ thực nghiệm, viền liền nét đậm là cho các nghiên cứu tiếp theo ; hình elip biểu thị cho các thực nghiệm cần tiến hành viền liền là phân tích, đánh giá; viền n t rời là thực nghiệm, khảo sát ; các nội dung biểu di n không có đường viền bao quanh biểu thị các đối tượng sử dụng để thực nghiệm.

- Ch tiêu quan sát và đánh giá: Tính phù hợp của quy trình chiết xuất đƣợc đánh giá qua hiệu quả thu nhận và khả năng tái lặp. Hiệu quả thu nhận đƣợc thể hiện thông qua hàm lƣợng quercetin và chất lƣợng chiết xuất. Trong đó, hàm lƣợng quercetin phụ thuộc vào sự ổn định của hoạt chất trong điều kiện chiết xuất cũng nhƣ khả năng trích ly và hiệu quả thu phân dịch chiết. Chất lƣợng chiết xuất đƣợc đánh giá thông qua hoạt tính chống oxy hóa. Khả năng tái lặp được đánh giá qua độ lệch chuẩn tương đối (RSD, %) [9, 29, 30, 62].

2.2.5.3. Đánh giá hoạt tính sinh học của chế phẩm

Hoạt tính sinh học in vitro và in vivo của các chế phẩm đƣợc tiến hành đánh giá theo sơ đồ đƣợc thể hiện trên hình 2.3. Trong hình 2.3, chế phẩm chứa quercetin ở các mức độ tinh khiết khác nhau từ dịch chiết toàn phần của cây thuốc hoặc từ thủy phân từ rutin, đƣợc đánh giá hoạt tính sinh học. Trong đó, hoạt tính sinh học in vitro đƣợc

Hàm lƣợng và/hoặc hoạt tính chống oxy hóa in vitro

Tinh chế cao chiết thô từ 1- 2 cây thuốc

lựa chọn

10 cao chiết thô trước và sau thủy phân

Nguyên liệu từ 10 cây thuốc 60-100g)

Điều kiện chiêt xuất lựa chọn

Hiệu quả trích ly Nụ hoa ho

chuẩn 10 g

Hiệu quả thủy phân rutin; Sự ổn định của quercetin Quercetin và

Rutin chuẩn Giải pháp và

thông số chiết xuất Điều kiện chiết xuất

theo cây thuốc 02g

02 loại chế phẩm quercetin

Đánh giá hoạt tính sinh học in vitro, in vivo

72

đánh giá trên đích tác dụng thuộc con đường chuyển hóa xenobiotic, gồm vi sinh vật, tế bào ung thƣ đại trực tràng. Hoạt tính sinh học in vivo đƣợc đánh giá trên cách tiếp cận duy trìu cân b ng giữa hoạt tính chống oxy hóa gia tăng GSH, giảm MDA và tiền chất oxy hóa giảm hoạt độ enzym ALT, AST . Đánh giá hoạt tính sinh học in vivo đƣợc thực hiện trên chuột nhắt trắng, theo mô hình thực nghiệm gây stress nhiệt tác nhân nhiệt độ và stress bệnh lý gan bị tổn thương do paracetamol).

Hình 2.3. Sơ đồ nghiên cứu đánh giá hoạt tính sinh học in vitro và in vivo

Ch thích: hình chữ nhật chứa đựng các dữ liệu viền liền là từ nghiên cứu của mục 2.2.1.6, viền n t rời là thu được từ thực nghiệm ; hình elip biểu thị cho các thực nghiệm cần tiến hành viền liền là phân tích, đánh giá; viền n t rời là thực nghiệm, khảo sát ; các nội dung biểu di n không có đường viền bao quanh biểu thị các đối tượng sử dụng để thực nghiệm.