Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.4. ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CHẾ PHẨM QUERCETIN THU NHẬN
3.4.1. Đánh giá hoạt tính in vitro của các chế phẩm quercetin từ nụ hoa ho
3.4.1.1. Hoạt tính kháng khuẩn của các chế phẩm quercetin
Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn của các mẫu đƣợc thể hiện ở bảng 3.12.
Bảng 3.12. Hoạt tính kháng khuẩn của các mẫu trong 2 dung môi Mẫu
Hoạt tính kháng khuẩn E. coli
ATCC 25922
S. aureus ATCC 25923
B. cereus ATCC 14579
B. subtilis ATCC 23857 MeOH DMSO MeOH DMSO MeOH DMSO MeOH DMSO
H1 (59,19%) +++ + +++ + +++ + ++ +
H2 (90,02 %) +++ + +++ + +++ + ++ +
S (10,85%) + - + - + - + +
QUE (91,62%) +++ + +++ + +++ + ++ +
Ampicillin ++ + ++ + ++ + ++ +
Methanol - - - -
DMSO - - - -
H2O - - - -
Ghi chỳ: - khụng cú hoạt tớnh ((ỉ) < 9 mm); + hoạt tớnh yếu ((ỉ) trong khoảng 10 – 12 mm);
++ hoạt tớnh trung bỡnh (ỉ cú giỏ trị từ 10-15 mm); +++ hoạt tớnh mạnh ((ỉ)>15 mm)
Kết quả thử cho thấy các mẫu đều có hoạt tính kháng khuẩn. Trong đó, hoạt tính kháng khuẩn của các mẫu khi đƣợc hòa tan trong methanol MeOH cao hơn trong DMSO 0,5%. Tiếp theo, dung môi MeOH đƣợc sử dụng để hòa tan mẫu cho nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa in vitro. Dung môi DMSO đƣợc sử dụng để hòa tan mẫu và phân tán mẫu vào nước cho nghiên cứu hoạt tính trên tế bào và trên chuột thí nghiệm.
3.4.1.2. Hoạt tính chống oxy hóa của các chế phẩm quercetin
Hoạt tính chống oxy hoá của các chế phẩm quercetin đƣợc thể hiện qua khả năng quét gốc tự do và năng lực khử bảng 3.13 .
Bảng 3.13. Hoạt tính chống oxy hóa của các mẫu nghiên cứu
Mẫu Khả năng quét gốc tự do (%) Năng lực khử (Abs)
H1 91,38 ± 0,68 1,94 ± 0,004
H2 76,36 ± 0,57 1,79 ± 0,006
S 55,19 ± 0,24 1,12 ± 0,002
QUE 86,65 ± 0,23 2,19 ± 0,008
Vitamin C 86,40 ± 0,89 1,31 ± 0,002
104
Từ bảng 3.13 ở cùng một nồng độ thử nghiệm, các mẫu đều có % quét gốc tự do trên 50% và năng lực khử với độ hấp phụ quang Abs trên 1. Khi đó, các mẫu này tiếp tục được xác định nồng độ ở IC50, nồng độ ở Abs1 theo đường chuẩn và t lệ giữa nồng độ mẫu ở Abs1 so với nồng độ mẫu ở IC50 (t lệ Abs1/IC50 , để đánh giá hoạt tính chống oxy hóa. Kết quả thể hiện ở hình 3.19 và 3.20.
Hình 3.19. Giá trị làm giảm 50% DPPH (IC50) (A) và giá trị có độ hấp thụ quang b ng 1 (Abs1) (B) của các mẫu quercetin
Kết quả cho thấy phần trăm quét gốc tự do so với nồng độ mẫu đƣợc xác định có mức độ tương quan tuyến tớnh chặt chẽ (r > 0,99). Nồng độ ở IC50 (àg/ml) của mẫu H1, H2, S, Que và vitamin C tương ứng 13,62, 16,35, 23,09, 14,35 và 15,30. Kết quả hình 3.19A, giá trị IC50 giảm dần theo thứ tự S, H2, vitamin C, QUE và H1. Kết quả đánh giá về năng lực khử qua phương trình tương quan tuyến tính (r > 0,99) cho thấy nồng độ Abs1 (àg/ml) của cỏc mẫu tương ứng theo thứ tự giảm là S (69,13), H2 (45,79), H1 (38,59) trong khi chất chuẩn QUE và vitamin C tương ứng là 33,56 àg/ml và 30,46 àg/ml (hỡnh 3.19B). Mối liờn hệ giữa hoạt tớnh chống oxy húa (anti-oxidant) và oxy hóa (pro-oxidant đƣợc đánh giá qua t số Abs1/IC50, thể hiện trên hình 3.20.
Hình 3.20. Mối liên hệ giữa hoạt tính chống oxy hóa (anti-oxidant) và oxy hóa (pro-oxidant)
Giá trị IC50 làm giảm50% DPPH 100àM của cỏc mẫu àg/ml)
Các mẫu quercetin
(A)
Năng lực khử độ hấp thụ quang b ng 1, Abs1 của cỏc mẫu àg/ml)
Các mẫu quercetin
(B)
Các mẫu chứa quercetin và vitamin C
T số Abs1 / IC50
105
Trên hình 3.20, t lệ Abs1/IC50 của các mẫu tương ứng giảm dần là S (2,99), H1 (2,83), H2 (2,80), Que (2,34), vitamin C (1,99). T lệ Abs1/IC50 ở S là cao nhất, sau đó đến H1 và H2 và đều cao hơn 2 mẫu đối chứng là quercetin chuẩn QUE và vitamin C (hình 3.20). Khả năng quét gốc tự do của mẫu H1là mạnh nhất so với các mẫu đƣợc nghiên cứu. Năng lực khử giá trị Abs1 của mẫu S cao nhất so với các mẫu còn lại.
3.4.1.3. Hoạt tính kháng tế bào ung thư của các chế phẩm quercetin Kết quả thể hiện trên bảng 3.14 và các hình 3.21, 3.22 và 3.23.
Bảng 3.14. Hoạt tính kháng tế bào ung thƣ HCT116 Mẫu
(nồng độ 20àg/ml )
Tỉ lệ giảm tế bào sống so với ban đầu trước khi ủ (%)
H1 60,76 ± 3,2
H2 54,42 ± 2,6
S 9,26 ± 0,96
QUE 48,12 ± 3,2
Theo bảng 3.14 và hình 3.21, các mẫu có t lệ giảm tế bào sống trên 50% là mẫu H1 và H2. Mẫu S từ lá sen có hoạt tính rất yếu. Hoạt tính kháng tế bào ung thƣ HCT116 ở bảng 3.14 cho thấy ở nồng độ 20 àg/ml, cỏc mẫu H1, H2, QUE thể hiện hoạt tính kháng tế bào ở mức thấp với t lệ sống sót của tế bào bị giảm tương ứng là 60,76%, 54,42% và 48,12%. Mẫu S không thể hiện hoạt tính với t lệ sống sót tế bào trờn 90%. Đối với mẫu QUE, đƣợc thử nghiệm thờm ở nồng độ 22 àg/ml và cho thấy ở nồng độ này đã có 64,22% tế bào bị gây độc % tế bào sống sót còn 35,78% .
0 20 40 60 80 100
0 5 10 15 20
T lệ sống sót của tế bào HCT116 (%)
Nồng độ cỏc chế phẩm quercetin àg/ml
H1 H2 S QUE
Hình 3.21. Tương quan giữa nồng độ mẫu thử và t lệ tế bào HCT 116 còn sống
` Trên hình 3.22 quan sát thấy tế bào mẫu đối chứng, tế bào đƣợc xử lý với môi trường DMSO 0,5% không có sự khác biệt. Hình ảnh cũng cho thấy mẫu H1 thể hiện khả năng ức chế sinh trưởng của tế bào ung thư tốt hơn so với mẫu H2, mẫu S và QUE.
106
Hình 3.22. Ảnh tế bào HCT116 trước và sau khi thử các mẫu tại thời điểm 48h (ĐCSH: đối chứng sinh học; DMSO: dung môi hòa tan mẫu, VK 10X, Zoom 5.6) Các mẫu H1, H2 tiếp tục đƣợc xác định giá trị IC50, so sánh với quercetin chuẩn (QUE) theo phương trình bậc 3. Từ đó, xác định giá trị IC50 của các mẫu H1, H2 và QUE lần lƣợt là 18,79 ± 0,90 àg/ml; 19,53 ± 0,51 àg/ml và 20,1 ± 0,61 àg/ml. Kết quả so sánh thể hiện trên hình 3.23.
0 5 10 15 20
H1 H2 QUE
IC50, àg/ml
Chế phẩm quercetin
Hình 3.23. So sánh giá trị IC50 gây giảm 50% tế bào sống
Kết quả so sánh 2 mẫu có hoạt tính là H1, H2 với QUE (hình 3.23) cho thấy giá trị ở IC50 của H1 là 18,79 àg/ml thấp nhất chứng tỏ cú hoạt tớnh khỏng thế bào ung thƣ cao nhất (giá trị pH1/QUE = 0,045 < 0,05; pH2/QUE = 0,176 > 0,05). Trong 3 mẫu nghiên cứu, mẫu S từ lá sen có hoạt tính kháng khuẩn và chống oxy hóa yếu nhất và không có hoạt tính kháng ung thƣ pha trong DMSO 0,5% . Các mẫu H1 và H2 tách từ nụ hoa hòe tiếp tục đƣợc nghiên cứu hoạt tính sinh học in vivo trên chuột.