Phillip và CS (1994), đã tách chiết thành công DNA từ gốc lông chim đã được lưu trữ trong vòng 1÷3 năm theo 2 phương pháp khác nhau là: phương pháp sử dụng proteinase K, ủ ở 56oC trong 4-12 giờ và phương pháp dùng Chelex 5%. Sau đó khuếch đại DNA tách chiết từ lông này bằng gen Cytb mtDNA (340bp) với cặp mồi L14841/H15149. Nhóm nghiên cứu đã thực hiện phản ứng PCR với tổng thể tích là 25µl, trong đó: dùng 1µl DNA khuôn đối với phương pháp thứ nhất hoặc 10µl DNA khuôn đối với tách chiết bằng Chelex 5%, 10mM Tris (pH=8,3), 50mM KCl, 0,01% gelatin, 1,5mM MgCl2, 0,1µg/µl BSA, 0,2mM mỗi dNTP, 0,4µM mỗi mồi và 1 đơn vị Taq polymerase. Phản ứng trên được chạy theo chu trình nhiệt: 40 chu kỳ của 92oC trong 1 phút, 55oC trong 1 phút và 74oC trong 30 giây. Kết quả nghiên cứu cho thấy DNA tách chiết theo phương pháp Chelex 5% cho chất lượng kém hơn phương pháp thứ nhất và sản phẩm khuếch đại PCR được đưa đi gải trình tự tạo cây phát sinh loài tốt [60].
Đối chiếu với nghiên cứu của chúng tôi, mặc dù sử dụng bộ kit MagaZorb DNA Mini-Prep Kit của Promega tách chiết DNA từ lông hiện đại hơn, thời gian ủ
proteinase K ở 56oC trong 16÷24 giờ lâu hơn nhưng DNA tách chiết tổng số rất thấp hoặc không có. Mặc khác, khi thực hiện phản ứng PCR, nồng độ DNA khuôn đối với mẫu lông đưa vào gấp 10 lần so với nghiên cứu của Phillip và CS (1994) và nhiệt độ lai ứng với cả 2 cặp mồi Cytb FW1/Cytb RV1 và Cytb FW1/Cytb RV2 là 54oC không khác biệt lắm so với nghiên cứu của Phillip và CS (1994). Sản phẩm PCR tách chiết từ mẫu lông (mẫu Y27-Trảng Bom, Đồng Nai) vẫn cho trình tự DNA tốt. Kết quả này có thể là do mẫu lông của chúng tôi thu được là lông bụng nhỏ, phần gốc lông ít hoặc không có.
3.3.3 Đa dạng di truyền quần thể chim yến A. fuciphagus
So sánh sự khác biệt trình tự giữa chim yến tại một số khu vực trên thế giới thì thấy trình tự khác biệt của cá thể có nguồn gốc từ Việt Nam (0,478%) cao hơn quần thể ở Thái Lan (0,2%) và thấp hơn nhiều so với quần thể ở Malaysia và Sumatra (2,13%).
Trong nghiên cứu này chúng tôi tạm gọi các cá thể yến ở Nha Trang-Khánh Hòa là A. fuciphagus. Mặc khác, dựa trên cây phát sinh loài (hình 3.10) ta thấy
nhóm yến Việt Nam bao gồm cả các haplotype của các cá thể yến đảo và yến nhà thu tại Nha Trang- Khánh Hòa. Điều này cho thấy quan hệ gần gũi của các haplotype này với nhóm yến được nghiên cứu bởi Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật Hà Nội-Việt Nam hay đó là sự gần gũi di truyền giữa cá thể yến Nha Trang-Khánh Hòa với nhóm yến A. f. germani. Mặc khác, theo Nguyễn Quang
Phách và cs thì nhóm yến cho tổ trắng ăn được (A. fuciphagus) chỉ phân bố ở khu vực miền Trung-Tây Nguyên Việt Nam [3], [4], [59] và các cá thể yến được nghiên cứu bởi Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật Hà Nội chưa xác định rõ là thu mẫu ở nơi nào trên Việt Nam, do đó sự gần gũi di truyền này là khá cao và có thể là cùng phân loài A. f. germane.
Cá thể yến ở Trảng Bom - Đồng Nai tách hẳn ra một nhóm với các cá thể yến ở Nha Trang-Khánh Hòa và thuộc nhóm yến ở Thái Lan, Malaysia_ Sumatra, Hồng Kông và Hà Lan. Khi tìm kiếm các trình tự tương đồng trên Blast thì cá thể yến ở Trảng Bom- Đồng Nai tương đồng với trình tự A. f. vestitus dựa trên phân tích
trình tự Cytb ở Malaysia nhất, % tương đồng cao đến 99%, giá trị E-value = 0. Do đó sự tương đồng giữa 2 trình tự này rất có ý nghĩa. Đối với các loài khác % bắt cặp không cao, đồng thời giá trị E-value cũng khá lớn thể hiện mức tin cậy thấp. Vì vậy, chúng tôi tạm gọi cá thể yến ở Trảng Bom-Đồng Nai là A. f. vestitus.
Price và CS (2005) nghiên cứu mối quan hệ phát sinh loài trên 62 cá thể chim yến sử dụng các trình tự Cyt-b (1058bp) phân tích dựa trên cây maximum likelihood (ML) đặt A. brevirostris là nhóm gần gũi với A. maximus và A. fuciphagus là nhóm gần gũi với A. salangana. Mặc khác, A. fuciphagus tách hẳn ra
nhánh đơn ngành khác biệt với A. maximus và H. gigas là nhóm trung gian giữa A.
maximus và A. fuciphagus. Mặc khác A. terraereginae là một nhóm gần gũi với A. fuciphagus, H. gigas và A. maximus [36]. Kết quả này khá tương đồng so với
nghiên cứu của chúng tôi
Kevin và CS (1999) nghiên cứu trên 18 cá thể chim yến sử dụng trình tự Cytb mtDNA (1037 cặp base), cho thấy A. elaphrus và A. francicus sự khác biệt
trình tự là 1,0%. Hai loài này là một nhánh đơn ngành của yến nhỏ có âm dội. A. elaphrus và A. francicus có quan hệ họ hàng rất gần nhau và là nhánh chị em với
loài A. salangana [39]. Kết quả này cũng được thể hiện rõ trên cây phát sinh loài
của chúng tôi, ngoài ra trên cây phát sinh loài còn thể hiện quần thể yến Việt Nam (A. fuciphagus) là nhóm gần gũi với loài A. salangana và có định vị bằng tiếng
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN KẾT LUẬN
1. Tách chiết được DNA tổng số của chim yến A. fuciphagus từ 2 mẫu lông và mô cơ thu tại Nha Trang- Khánh Hòa.
2. Tối ưu hóa phản ứng khuếch đại gen Cytb mtDNA của chim yến nói trên. Nồng độ DNA dùng cho phản ứng PCR, đối với mẫu mô cơ là 1µl, mẫu lông chim là 10µl. Nồng độ mồi dùng trong phản ứng PCR: Cytb FW1/Cytb RV1 (10µM/l) là 1µl, Cytb FW1/Cytb RV2 (10µM/l) là 0,75µl. Chương trình nhiệt phản ứng khuếch đại gen Cytb mtDNA (sử dụng được cho cả 2 cặp mồi: mồi xuôi FW1- mồi ngược RV1 và mồi xuôi FW1- mồi ngược RV2) như sau: biến tính ban đầu tại 95oC trong 3 phút, sau đó là 35 chu kỳ của 95oC trong 30 giây, 52oC trong 30 giây, 72oC trong 1 phút, cuối cùng là bước kéo dài tại 72oC trong 15 phút.
3. So sánh đặc điểm hình thái loài A. fuciphagus thu tại đảo A2-Hòn Mun và 155-
Thống Nhất-Nha Trang với các loài trên thế giới không có gì khác biệt lắm. Về mặt kích thước: chiều dài cánh, trong lượng trung bình của các mẫu thu tại Khánh Hòa có kích thước tương đồng với các mẫu trên thế giới.
4. Xây dựng cây đa dạng loài (sử dụng chỉ thị phân tử Cytb mtDNA) và khảo sát sự đa dạng di truyền của loài chim yến A. fuciphagus tại Nha Trang-Khánh Hòa. Quần thể A. fuciphagus thể hiện sự đa dạng di truyền ở mức độ trung bình
- Quần thể A. fuciphagus thu tại đảo A2-Hòn Mun-Nha Trang thu được 2
haplotype trên tổng số 11 cá thể. Sự khác biệt trình tự của quần thể chim yến này là 1,5% và tại Khánh Hòa là 0,725%.
- Quần thể A. fuciphagus thu tại 155-Thống Nhất-Nha Trang thu được 3
haplotype trên tổng số 8 cá thể. Sự khác biệt trình tự của quần thể chim yến này là 0,5% và tại Khánh Hòa là 0,725%.
ĐỀ XUẤT Ý KIẾN
1. Tiếp tục thu mẫu với số lượng nhiều hơn và mở rộng địa điểm thu mẫu
2. Khảo sát đa dạng di truyền trên một số quần thể chim yến khác đang có nguy cơ tuyệt chủng để khôi phục bầy đàn, tìm loài mới và xây dựng bản đồ phân bố
TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Đinh Thị Phương Anh (2011). Nghiên cứu một số đặc điểm sinh thái học của chim Yến Hàng trong điều kiện tự nhiên tại đảo Cù Lao Chàm, Hội An Quảng Nam, Tạp chí khoa học và công nghệ đại học Đà Nẵng, số 3(44)
2. Lê Tiến, Nguyễn Đăng Tôn, Vũ Hải Chi, Địch Thị Kim Hương, Lê Thị Thúy, Nông Văn Hải (2009), “ Đa hình trình tự vùng điều khiển (D-loop) hệ gen ty thể của gà Ri, gà Đông Tảo và gà Tre” Tạp Chí Công Nghệ Sinh hoc 7(2)
3. Nguyễn Quang Phách (1993), Cơ sở sinh học của việc khai thác hợp lý, bảo vệ và phát triển nguồn lợi chim yến hàng (collocalia fuciphaga germani Oustalet) ở Việt Nam, luận án phó tiến sĩ, Đại học Quốc gia Hà Nội.
4. Nguyễn Quang Phách, Hồ Thế Ân và cộng sự (1999), Tuyển tập tóm tắt các kết quả đề tài nghiên cứu ứng dụng khoa học công nghệvà môi trường tỉnh Khánh Hoà 10 năm (1989 – 1999), Sở KHCN & MT Khánh Hoà.
5. Nguyễn Quang Phách. “Yến Sào Khánh Hòa- Tổ yến vua”. Đại học Cần Thơ. Truy cập 10 tháng 4 năm 2010.
6. PGS. TS Nguyễn Khoa Diệu Thu, KS Nguyễn Phương Nam. CN Đặng Văn Nguyên, CN Nguyễn Xuân Mai, Nguyễn Văn Tuyên (2009). Nghiên cứu nuôi thử nghiệm chim yến trong nhà để lấy tổ tại bán đảo Phương Mai Bình Định.
TÀI LIỆU NƢỚC NGOÀI
7. Aowphol A, Voris HK, Feldheim KA, Harnyuttanakorn P, Thirakhupt K. Genetic homogeneity among colonies of the white-nest swiftlet (Aerodramus fuciphagus) in Thai Lan. Zoolog Sci. 2008 Apr; 25(4): 372-80. PubMed PMID: 18459819
8. Avise J.C. (1994), "Molecular markers: natural history and evolution", Chapman and Hall, New York, USA.
9. Brown W.M., George M.B., Wilson A.C. (1979), “Rapid evolution of animal mitochondrial DNA”, Proc Natl Acad Sci USA, 76(4), pp.1967-1971.
10. Brooke, R. K. (1972) Bull. Brit. Orn. Cl. 92, 53-57
11. Brown W.M., Prager E.M., Wang A., Wilson A.C. (1982), "Mitochondrial DNA sequences of primates: tempo and mode of evolution", J Mol Biol, 18(4), pp.225-239.
12. Berlin S., Ellegren H. (2001), “Evolutionary genetics. Clonal inheritance of avian mitochondrial DNA”, Nature, 41(6851), pp.37-38.
13. Chantler, P., Wells, D.R. and Schuchmann, K.L. (1999) Order Apodidae. In: Del Hoyo, J., Elliott, A. and Sargatal, J. (eds.) Handbook of the birds of the world. Volume 5. Barnowls to Hummingbirds. Lynx Edicions, Barcelona. pp. 338-457. 14. Cheng G.C., Li u K.F., Zhang Q., Wang L., Duan Z. X., Li X.Y., Liu R. S., and Yu, Q. (1996). Studies on genetic relationship between red jungle fowl (Gallus gallus) and domestic fowl (Gallus domesticus). Acta Genet. Sin.,23:96.
15. Cranbrook, Earl of, S. Somadikarta and S.N. Kartikasari. 1996. Swiftlets (Aves, Apodidae, “Collocalini”): An annotated bibliography prepared for the Department of the Environment. Global Wildlife Division, The Department of the Environment, Bristol.
16. Desjardins P & Morais R (1990) Sequence and gene organisation of the chicken mitochondrialgenome. A novel gene order in higher vertebrates. J Mol Biol 212: 599-634.
17. Desjardins P & Morais R (1991) Nucleotide sequence and evolution of coding and noncodingregions of a quail mitochondrial genome. J Mol Evol 32: 153- 161.
18. Downes, C.M., and B.T. Collins.1996. The Canadian Breeding Bird Survey, 1966-1994. Can. Wildl. Serv. Prog. Notes No. 210. 36 pp. Key Words:population trends; Canada; regional analysis
19. Drummond AJ, Ashton B, Buxton S, Cheung M, Cooper A, Heled J, Kearse M, Moir R, Stones-Havas S, Sturrock S, Thierer T, Wilson A (2011).
20. Esposti MD, De Vries S, Crimi M, Ghelli A, Patarnello T & Meyer A (1993) Mitochondrialcytochrome b: evolution and structure of the protein. Biocimica et Biophysica Acta 1143: 243-271.
21. E. Nugroho, Dvm. 2000. The book: The Guidebook to Breeding Swiftlets in Farming Houses. 165 paper
22. Fernández-Moreno A.M., Bornstein B., Petit N., Garesse R. (2000), “The pathophysiology of mitochondrial biogenesis: Towards four decades of mitochondrial DNA research”, Mol Genet Metab, 71(3), pp.481-495.
23. Friesen VL, Montevecchi WA, Baker AJ, Barrets RT & Davidson WS (1996) Populationdifferentiation and evolution in the common guillemot Uuria aalge. Mol Ecol 5: 793-805
24. Gongora J., Rawlence N.J., Mobegi V.A., Alcalde J.A., Mtus J.T., Hanotte O., Moran C., Austin J.J., Ulm S., Andersson A.J., Larson G., Cooper A. (2008) Indo-European and Asian origins for Chilean and Pacific chicken revealed by mtDNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,105(30):10308-10313
25. Glenister, A.G. 1971. The Birds of the Malay Peninsular Singapore and Penang. Dai Nippon Printing, Hong Kong.
26. Grande, C, Templado, J, Zardoya, R. 2008. Evolution of gastropod mitochondrial genome arrangements. BMC Evolutionary Biology. 8: 61. 15p.
27. Hackett SJ (1996) Molecular phylogenetics and biogeography of Tanagers in the genus Ramphocelus (Aves). Mol Phyl Evol 5: 368-382.
28. Hayashi Y., Nishida T, Fujioka T., Tsugiyama I. and Mochizuki K.(1985), "Osteometrical studies on the phylogenetic relationships of Japanese native fowls", Nippon Juigaku Zasshi, 47(1), pp.25-37.
29. Helm-Bychowski K & Cracraft J (1993) Recovering phylogenetic signal from DNA sequences: Relationships within the Corvine assemblage (Class Aves) as inferred from complete sequencesof the mitochondrial DNA cytochromeb gene. Mol Biol Evol 10: 1196-1214
30. Henri Thomassen. 2005. Swift as sound Design and evolution of the echolocation system in Swiftlets (Apodidae: Collocaliini). Chapter 6: 139-153. 31. Henri A. Thomassen, Robert- Jan den Tex, Merijn A.G.de Bakker, G. David E. Povel. Phylogenetic relationships amongst swifts and swiftlets : A multi locus approach. Molecular Phylogenetics and Evolution
32. Houdret, N., Lhermitte, M., Degand, P. & Roussel, Ph. 1975. Purification et es étude chimique d’une glycoprotein de Collocalia. Biochime 57: 603-608
33. Huelsenbeck, J., Ronquist, P.F. (2001).MRBAYES: Bayesian inference of phylogenetic trees. Bioinformatics. 17:754–755.
34. Ingman M. (2003), “Mitochondrial genome variation and evolutionary history of Australian and New Guinean aborigines”, Genome Res, 13(7), pp.1600- 1606.
35. Irwin DM, Kocher TD & Wilson AC (1991) Evolution of the cytochromeb gene in mammals. JMol Evol 32: 128-144.
36. J. Jordan Price, Kevin P. Johnson, Sarah E. Bush & Dale H. Clayton. “Phylogenetic relationships of the Papuan Swiftlets Aerodramus papuensis and implications for the evolution of avian echolocation”. Lbis (2005), 147, 790-796. 37. Kanginakudru S., Metta M., Jakati R.D., Nagaraju J.(2008), “Genetic evidence from Indian red jungle fowl corroborates multiple domestication of modern day chicken”, BMC Evol Biol, 8:174.
38. Kathan, R.H. & Weeks, D.I. 1969. Structure studies of Collocalia mucoids. Archives of Biochemistry and Biophysics 134: 572-576
39. Kevin P.Johnson & Dale H. Clayton.“Swiftlets on islands: genetics and phylogeny of the Seychelles and Mascarene swiftlets”. Phelsuma 7 (1999); 9-13. 40. Kumar,S., Tamura,K., Nei,M., 2004. Mega3: integrated software for molecular evolutionary genetics analysis and sequence alignment. Brief. Bioinform. 5, 150-163
41. Lee PLM, Clayton DH, Griffiths R & Page RDM (1996) Does behaviour reflect phylogeny inswiftlets (Aves: Apodidae)? A test using cytochromeb mitochondrial sequences. Proc Natl AcadSci USA 93: 7091-7096
42. Li S.,Aggrey S.E., Zadworny D., Fairfull W. and Kuhnlein U.(1998), “Evindence for a genetic variation in the mitochondrial genome affecting traits in White Leghorn chickens”, J Hered, 89(3), pp.222-226.
43. Mayr Gerald (2003): Phylogeny of early tertiary swifts and hummingbirds (Aves: Apodiformes). Auk 120(1): 145–15.
44. Medway, Lord & Pye, J.D. 1977. Echolocation and the systematic of the swiftlets. In: Stonehouse, B. & Perrins, C. [eds] Evolutionary Ecology, MacMilla, London: 226-238.
45. Medway L. (1959) Echolocation among Collocalia. Nature 184: 1352-1353 46. Medway, L. (1966) Field characters as a guide to the specific relations of swiftlets. Proceedings of the Linaean Society London 177(2): 151-177.
47. Meyer A (1994) Shortcomings of the cytochromeb gene as a molecular marker. TREE 9: 278-280.
48. Mindell DP, Sorenson MD & Dimcheff DE (1998) Multiple independent origins of mitochondrialgene order in birds. Proc Natl Acad Sci USA 95: 10693- 10697.
49. Moore WS & DeFilipps VR (1997) Taxonomic resolution based on cytochromeb DNA. In AvianMolecular Evolution and Systematics (ed. Mindell DP). Academic Press, San Diego, California
50. Moiseyeva I.G., Romanov M.N., Nikiforov A.A., Sevastyanove A.A., Semyenova S. K. (2002) Evolutionary relationships of Red jungle fowl and chicken breeds. Genet. Sel. Evol., 35(2003): 403-423
51. Natalia Bello, Olga Francino, Armand Sanchez. Isolation of genomic DNA from feathers. J Vet Diagn Invest 13:162–164 (2001)
52. Nei, M., 1987. Molecular Evolutionary Genetics. Columbia University Press, New York.
53. Nguyen Dang Ton, Dich Thi Kim Huong, Vu Hai Chi, Huynh Thu Hue, Le Thi Thuy, Nong Van Hai (2008), "Polymorphism of mitochondrial and DNA control (D-loop) region in four Vietnamses chicken breeds ",13thAAAP Animal Sciences Congress Hanoi - Vietnam September 22 -26, 2008
54. Nguyên Quang, P. & Voisin, J. F. 2001. Bats and rodents in swiftlet caves in Việt Nam. Mammalia 65: 253-257.
55. Nugroho, E. &Whendrato, I. 1996. The farming of edible-nest swiftlets in Indonesia. In: Proceedings of the Technical Workshop on Conservation Priorities for the Sustainability of Harvesting and Trade in Nests of Swiftlets of the genus Collocalia that Feature Prominently in the Bird-trande, Surabaya, 4-7 November 1996.
56. Oka T., Ino Y., Nomura K., Kawashima S., Kuwayama T., Hanada H., Amano T.,Takada M., Takahata N., Hayashi Y., Akishinonomiya F. (2007) Analysis of mtDNAsequences shows Japanese native chickens have multiple origins. Anim. Genet., 38: 287-293.
57. Page, R. D. (1996). TreeView: an application to display phylogenetic trees on personal computers. Computer Application Bioscience, 12, 357–358.
58. Peter Leeton and Leslie Christidis. “Feathers from museum brid skins- a good source of DNA for phylogenetic studies”. The Condor 95: 465-466. The Cooper Ornithological Society 1993.
59. Phach Nguyen Quang, Yen Vo Quang và Jean-François VOISIN. A Monograph, with Special Reference to Vietnamese Populations. NXB N. Boubée, 9 rue de Savoie, 75006 Paris (2002), 297 trang, ISBN : 2-85004-103-3
60. Phillip A. Morin, Jeanne Messier and David S. Woodruff. DNA extraction, amplification, and direct sequencing from hornbill feathers. J.Sco. Thai Lan, 20