2.2.1 Nghiên cứu đặc điểm hình thái
Tiến hành chọn ngẫu nhiên nhiều con chim yến để làm mẫu nghiên cứu. Dùng thước có chia độ đo (đơn vị nhỏ nhất: mm) để đo chiều dài cánh, chiều dài sải cánh, chiều dài đuôi. Sau đó dùng cân phân tích để cân trọng lượng chim. Quan sát màu sắc lông chim, hình dáng bên ngoài (Bảng 2.1).
Bảng 2.1 Một số miêu tả đặc điểm hình thái của chim yến hàng
Đặc điểm Yến nhà Yến đảo
Hình thái bên ngoài
Bộ lông trơn nhẵn, không xẻ đuôi, mắt tròn nâu đen. Mỏ
đen, nhỏ và vập xuống
Bộ lông trơn nhẵn, không xẻ đuôi, mắt tròn
nâu đen. Mỏ đen, nhỏ và vập xuống Màu sắc Lông mình xám đen và ánh
xanh ở đuôi
Lông mình nâu đen và xám nhạt dưới bụng
Chiều dài cánh (cm) 11÷12 11,5 ÷12,2
Chiều dài sải cánh (cm) 12÷13 12,3÷13,5
Chiều dài đuôi (cm) 4÷5 4,5÷ 4,6
Trọng lượng (gram) 12÷13 12,09÷14,28
2.2.2 Nghiên cứu đa dạng di truyền của chim yến (Apodidae)
Quy trình tách chiết DNA, khuếch đại gen và giải trình tự được tiến hành theo các bước sau:
2.2.2.1 Tách chiết DNA tổng số
a) Tách chiết DNA từ mẫu mô cơ
DNA được tách chiết từ mẫu cơ của từng cá thể chim yến con (thu mẫu trực tiếp từ công nhân của công ty Yến Sào Khánh Hòa, giữ mẫu trong đá băng, sau đó được bảo quản ở -70oC) bằng dung dịch 10% Chelex [76]:
Dùng panh và kéo vô trùng cắt một mẩu nhỏ khoảng 0,2cm2 mẫu mô cơ rồi cho vào 300µl dung dịch chelex 10% (Cân 5g chelex vào 50ml nước sạch. Sau đó đặt cốc dung dich chelex lên máy khuấy từ, vừa khuấy vừa hút 300µl cho vào ống eppendorf 1ml) toàn bộ mẫu phải nằm trong lớp chứa Chelex. Sau đó ủ mẫu trên block nhiệt ở 95oC trong 5-6 giờ. Lấy ra vortex kĩ hỗn hợp trong 30 giây, rồi ly tâm lạnh 5000 vòng trong 5 phút. Sau cùng hút dịch nổi huyền phù sang ống eppendorf mới, DNA thu được sẽ được bảo quản trong tủ đông -40oC.
b) Tách chiết DNA từ mẫu lông
DNA được tách chiết từ mẫu lông của từng cá thể chim yến bằng bộ kit MagaZorb DNA Mini-Prep Kit (Promega) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Thực hiện quy trình sản xuất theo các bước sau:
Lấy 2÷4 mẫu lông bụng chim yến cho vào ống eppendorf 1,5ml đã khử trùng. Dùng kéo nhọn cắt thật nhỏ các lông chim và đẩy dồn phần mẫu xuống đáy của ống để tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình thủy phân sau này. Sau đó thêm 20µl dung dịch protein K vào. Đem vortex trong 15 giây. Tiếp đến hút 200µl Lysis Buffer cho vào ống tube. Vortex nhẹ đến khi hỗn hợp dung dịch mẫu/protein K/Lysis Buffer đồng nhất, thường là 15 giây. Ủ ống mẫu trên block nhiệt trong 16 giờ ÷24 giờ ở 56oC.
Thêm 500µl dung dịch Binding Buffer đã được vortex nhẹ cho vào ống mẫu. Vortex nhẹ cho đến khi hỗn hợp đồng nhất, thường là 15 giây. Thêm 20µl thuốc thử MagaZorb trực tiếp vào dung dịch, vortex nhẹ trong 15 giây. Ủ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút, vừa ủ vừa lật úp tube đảm bảo dung dịch được trộn đều. Lắng đọng trầm tích các hạt MagaZorb bằng cách sử dụng một rack từ, khoảng 4-5 phút. Sau
đó đảo ngược nam châm 2-3 lần để “rửa” sạch nắp ống với các nỗi trên mặt. Cẩn thận hút bỏ chất lỏng, càng nhiều càng tốt, không để loại bỏ bất kì hạt nào.
Thêm 1ml dung dịch đệm rửa vào tube. Sau đó nghịch đảo tube vài lần cho các hạt phân tán hoàn toàn. Cặn lắng các hạt trên rack từ, giống bước trên. Loại bỏ dịch nổi, chất lỏng. Lặp lại bước rửa 1-2 lần nữa. Sau đó ly tâm khô, để loại bỏ hoàn toàn dịch lỏng.
Thêm 100µl dung dịch đệm rửa giải cho vào tube. Ủ tube trong 10 phút ở nhiệt độ phòng, vừa ủ vừa nghịch đảo tube. Cặn lắng các hạt trên rack từ. Cẩn thận hút dịch nổi, tránh hút các hạt sang tube sạch mới. Tube mới chứa DNA đã được tách chiết tổng lượng là 100µl, sau đó bảo quản ở -20oC cho các phân tích tiếp theo.
2.2.2.2 Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction)
a) Mục đích:
Nhân lên đoạn gen mong muốn (gen cytochrome b mitochondrial DNA) với số lượng nhiều.
b) Nguyên lý phản ứng
Phương pháp PCR được Kary Mullis phát minh vào năm 1985.
Về nguyên tắc, một chu kỳ nhiệt độ gồm 3 giai đoạn nhiệt độ: Đầu tiên là giai đoạn biến tính ở 91oC-97oC làm biến tính mẫu DNA kép thành các chuỗi đơn; tiếp đến là giai đoạn bắt cặp mồi nhiệt độ ở 55oC-65oC, các đoạn mồi oligonucleotide ngắn gắn với các chuỗi DNA đơn; cuối cùng là kéo dài ở 68oC- 73oC, enzyme Taq polymerase để kéo các dNTP lại đầu 3’ của đoạn mồi đang bắt cặp trên đầu 5’ của sợi DNA đích để bắt nguồn cho sự tổng hợp nên mạch bổ sung.
Như vậy, số lượng các bản DNA sao chép tăng lên gấp đôi ở mỗi chu kì. Đây là sự khuếch đại theo cấp số nhân. Theo lý thuyết, kết quả sau n chu kì của phản ứng sẽ có 2n bản sao phân tử DNA mạch kép nằm giữa 2 đoạn mồi.
c) Thiết kế mồi cho phản ứng PCR:
Trong nghiên cứu này sử dụng 2 cặp mồi Cytb FW1_Cytb RV1 và Cytb FW1_Cytb RV2 được thiết kế dựa trên tham khảo của cặp mồi ND5_Thr để nhân lên đoạn gen Cytb mtDNA chim yến (Bảng 2.2).
Bảng 2.2 Trình tự cặp mồi khuếch đại đoạn gen Cytb của mtDNA
- Phương pháp đánh giá mồi:
Các thông số của mồi được kiểm tra bằng các phần mềm Oligo Analyzer, ClustalX 2.0.12, chương trình BLAST trên NCBI, cùng các trình tự bộ gen A. fuciphagus được lấy từ Genebank, cặp mồi sẽ được kiểm tra trên lý thuyết nhằm
đảm bảo các yêu cầu về kích thước, % GC, nhiệt độ biến tính, khả năng bắt cặp đặc hiệu của mồi, trước khi được ứng dụng vào thực nghiệm.
- Phương pháp xác định nồng độ mồi tối ưu:
Đầu tiên, chúng tôi tiến hành xác định nồng độ mồi tối ưu cho phản ứng PCR trên DNA được tách chiết từ mẫu cơ, sau đó sẽ áp dụng cho mẫu DNA tách chiết từ mẫu lông. Để xác định độ nhạy của mồi, chúng tôi tiến hành khảo sát ở các nồng độ mồi (10µM/l) khác nhau từ 0,25µl; 0,5µl; 0,75µl; 1µl; 1,25µl; 1,5µl với các điều kiện khác của phản ứng vẫn giữ nguyên. Phản ứng được tiến hành với tổng thể tích 50µl gồm: 1µl khuôn DNA, 5µl 10X Dream Taq Buffer, 0,25mM mỗi loại dNTP, 2mM MgCl2, 1 đơn vị Taq polymerase (5U/1µl), nồng độ mồi được thay đổi như trên và nước cho đủ thể tích.
- Phương pháp xác định nhiệt độ lai tối ưu của mồi (Ta)
Từ nhiệt độ biến tính của mồi xuôi và mồi ngược được sử dụng, tiến hành khảo sát nhiệt độ lai cho phản ứng theo công thức:
Gen Mồi xuôi Mồi ngƣợc
Cytb mtDNA Cytb FW1: 5’GGGGGATTCTCAGT AGACAA 3’ Tm: 53,5oC Trọng lượng phân tử (MW): 6206.1g/mole 6.4 OD260 = 31.1 nMoles Cytb RV1: 5’AGGTTGGCTACT AGGTT 3’ Tm: 53,6oC; Trọng lượng phân tử: 5585.7 g/mole 7.2OD260=39.6nMoles Cytb RV2: 5’TCTTTGGTTTAC AAACCAAT 3’ Tm: 53,1oC Trọng lượng phân tử: 6395.2 g/mole 6.3OD260=27,5nMoles
Nguồn Thomassen, H.A và CS. [74] Tự thiết kế Desjardins và Morais cùng CS, 1990 [16], [48]
Ta = (Tm primer F + Tm primer R)/ 2±5oC
Ta (annealing temperature) là nhiệt độ cho phép mồi bắt cặp bổ sung với mạch khuôn mẫu. Ta thường chênh lệch 5 – 10oC so với Tm (melting temperature). Tm còn được gọi là nhiệt độ nóng chảy của DNA, là nhiệt độ mà tại đó một nửa số liên kết hydro nối hai mạch DNA bị phá vỡ. Mỗi mồi đều có Tm riêng tùy thuộc vào thành phần và số lượng nucleotide tạo thành mồi đó. Tương tự, mỗi mồi cũng có khoảng nhiệt độ mà ở đó chúng bắt cặp tốt nhất và đặc hiệu nhất với mạch khuôn. Do đó, để phản ứng PCR đạt hiệu quả cao cần chọn Ta gần Tm để mồi bắt cặp bổ sung hoàn toàn với mạch khuôn chứa đoạn DNA cần khuếch đại và sau phản ứng PCR chỉ thu nhận sản phẩm khuếch đại mong muốn và không có vạch kí sinh nào.
Do đó, để xác định nhiệt độ lai tối ưu của mồi, chúng tôi tiến hành khảo sát nhiệt độ lai cho 2 cặp mồi Cytb FW1/Cytb RV1 và Cytb FW1/Cytb RV2 ở các mức nhiệt độ từ 51oC, 52oC, 53oC, 54oC, 55oC, 56oC và 57oC. Trừ sự thay đổi về nhiệt độ lai, các thành phần khác và các điều kiện của phản ứng đều không đổi. Phản ứng được chạy trên chương trình gradient nhiệt độ được thiết lập trên máy PCR. Sau đó tiến hành phân tích kết quả để tìm ra nhiệt độ lai tối ưu nhất cho cả quy trình.
- Xác định nồng độ DNA khuôn đối với các mẫu DNA tách chiết từ lông chim yến.
Chúng tôi tiến hành khảo sát các nồng độ DNA tách chiết từ mẫu lông chim yến khác nhau từ 4µl; 6µl; 8µl; 10µl; 12µl; 14µl. Ứng với mỗi nồng độ trên sẽ được khảo sát với những điều kiện tối ưu đã được xác định từ các thí nghiệm trên.
d) Phƣơng pháp tiến hành
Phản ứng PCR được tiến hành với tổng thể tích 50µl gồm: 1µl khuôn DNA đối với DNA tách chiết từ mẫu cơ hoặc 10µl khuôn DNA đối với DNA tách chiết từ mẫu lông, 5µl 10X Dream Taq Buffer, 0,25mM mỗi loại dNTP, 2µM mỗi mồi (10mM), 2mM MgCl2, 1 đơn vị Taq polymerase (5U/1µl) và nước cho đủ thể tích.
Phản ứng được chạy trên máy luân nhiệt Icycler (Bio-Rad) theo chu trình nhiệt độ: biến tính ban đầu tại 95oC trong 3 phút; sau đó là 35 chu kỳ của 95oC trong 30 giây, 54oC trong 30 giây, 72oC trong 1 phút; cuối cùng là bước kéo dài
72oC trong 15 phút. Sau khi chạy PCR xong nếu chưa lấy mẫu ngay thì có thể cài đặt máy ở chế độ bảo quản mẫu 20oC (Hình 2.2).
Hình 2.2 Chương trình nhiệt cho phản ứng PCR
2.2.2.3 Điện di gel agarose
Chuẩn bị gel agarose 1,5%: Lấy 0,6 gram agarose vào 40ml đệm SB 1X chứa trong bình tam giác 100ml. Đun sôi cách thủy cho đến khi gel tan hoàn toàn, để nguội đến nhiệt độ khoảng 60oC-70oC. Thêm 2µl ethidium bromide 10mg/ml vào bình, lắc nhẹ tránh tạo bọt để trộn đều ethidium bromide vào gel (hóa chất này độc hại cần tuyệt đối cẩn thận khi thao tác). Đổ gel ra khuôn đã sắp sẵn lược, độ dày của khuôn không ít hơn 0,8cm. Khi gel nguội hoàn toàn và đông cứng lại, rút nhẹ các bản lược ra.
Chạy điện di: Cho gel vào bồn điện di và thêm đệm SB 1X cho đến khi ngập bản gel. Trộn đều 3µl mẫu với 2µl loading dye 6X tra vào các giếng. Hút 3µl DNA Ladder (thang DNA) vào 1 giếng. Tiến hành chạy điện di với nguồn 80V trong 20-30 phút.
Đọc kết quả: Sau khi chạy xong, lấy gel đặt lên bàn UV của máy Gel Doc (Bio Rad). Xem các thang DNA dưới tia sáng của đèn cực tím
2.2.2.4 Giải trình tự
a) Nguyên tắc:
Giải trình tự của gen là phát hiện được thứ tự sắp xếp của 4 loại nucleotide, đó là A (adenine), C (cytosine), G (guanine) và T (thymine) trên phân tử DNA.
Trước hết chèn các đoạn DNA cần phải xác định trình tự vào một vector là phage hay plasmid tại một vị trí mà trình tự chuỗi của vị trí này được xác định rõ. Chuyển các vector mang đoạn chèn DNA này vào tế bào vikhuẩn để nhân bản các vector thành nhiều bản sao, sau đó tách chiết và tinh khiết các vector từ vi khuẩn để thành các vector tự do.
Dùng các đoạn mồi bổ sung một cách đặc hiệu với trình tự của vector tại vị trí chèn đoạn DNA. Thêm vào ống phản ứng men DNA polymerase và 4 loại nucleotide tự do (gọi là dNTP: deoxynucleotide triphosphate) và một lượng giới hạn các nucleotide tận (ddNTP: dideoxynucleotide triphosphate, cũng như dNTP có 4 loại ddNTP tương ứng với 4 base A, T, G, C), phản ứng được thực hiện trong 4 ống và mỗi ống cho một loại ddNTP khác nhau. Bắt đầu từ đoạn mồi, enzyme DNA polymerase sẽ kéo các dNTP vào để tổng hợp mạch đơn bổ sung với mạch DNA chèn trên vector, và sự tổng hợp mạch đơn sẽ bị dừng lại tại vị trí mà ddNTP được kéo vào thay vì dNTP. Nhờ vậy trong ống phản ứng có các mạch đơn DNA có các chiều dài khác nhau tương ứng với các vị trí trình tự các nucleotide trên đoạn DNA gốc.
Để thực hiện giải trình tự bằng máy tự động (automated sequencer) thì các mạch DNA đơn sản sinh trong ống phản ứng giải trình tự phải được đánh dấu huỳnh quang để các vạch điện di của các mạch đơn này được phát sáng khi đi qua một chùm tia sáng laser. Nguyên tắc hoạt động của máy là trong suốt quá trình điện di, mỗi khi có một vạch điện di đi qua chum tia laser thì vạch điện di sẽ phát sáng lên và sự phát sáng này sẽ được con mắt cảm quang ghi nhận và lưu lại thành một đỉnh cường độ sáng trong biểu đồ. Từ biểu đồ của các đỉnh cường độ sáng này, máy sẽ so dòng của các đỉnh tương ứng với các màu để cuối cùng phân tích thành trình tự của đoạn DNA cần giải trình tự.
b) Tiến hành:
Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng bộ “Wizard SV Gel and PCR clean-up Sytem” của Promega theo hướng dẫn của nhà sản xuất và sử dụng làm khuôn trực tiếp cho phản ứng tiền giải trình tự theo nguyên tắc dye-labelled dideoxy terminator (Big Dye® Terminator v.3.1, Applied Biosystems) với các đoạn mồi Cytb FW1, Cytb RV1 và Cytb RV2 tương tự như phản ứng PCR, theo chương trình nhiệt như sau: 96oC trong 20 giây, 50oC trong 20 giây và 60oC trong 4 phút.
Sản phẩm phản ứng được phân tích trên máy phân tích trình tự tự động ABI Prism® 3700 DNA Analyser (Applied Biosystems). Các trình tự được kết nối bằng kỹ thuật Contig Express trong phần mềm package Vector NTI v.9.
2.2.2.5 Xử lý số liệu xây dựng cây phát sinh loài
a) Phân tích sự đa dạng của chim yến:
Trình tự cho mỗi locus liên kết, chỉnh sửa, và loại bỏ đi đoạn mồi để có chiều dài chung bằng cách sử dụng phần mềm lắp ráp trình tự DNA và phân tích GENEIOUS PRO 5.5 [19]. Trình tự đã được xử lý sẽ được nhập vào BLAST để tìm kiếm các trình tự tương đồng [77].
b) Phân tích đa dạng di truyền chim yến (swiftlets) dựa trên haplotype:
Đa dạng di truyền (Genetic diversity) giữa các quần thể được tính bằng tổng số haplotype (k), số lượng của vị trí đa hình – polymorphic sites (s), đa dạng haplotype – haplotype diversity (d) và đa dạng nucleotide – nucleotide diversity ( số đột biến (Eta).
c) So sánh trình tự của chim yến
Sự khác biệt di truyền giữa các cặp trình tự của các loài cần so sánh được tính toán theo công thức:
d) Phân tích mối quan hệ phát sinh loài (phylogenetic analysis):
Các phân tích được thực hiện dựa trên tập hợp các trình tự gen Cytb mtDNA của chim yến thu tại Nha Trang, Đồng Nai từ tháng 3 đến tháng 6 năm 2012 bao
gồm: 65 trình tự, trong đó có 20 trình tự từ nghiên cứu hiện tại (11 trình tự từ yến đảo, 8 trình tự từ yến nhà ở Khánh Hòa và 1 trình tự từ Đồng Nai) và 45 trình tự từ Genbank.
Thông tin về các trình tự, mã số gen của các loài chim yến được trình bày ở bảng 2.3. Trình tự của 2 loài chim yến Apus apus (JQ353928) và Amazilia tzacatl (U89180) từ Genbank được sử dụng làm nhóm ngoại trong tấc cả các phân tích [43], [62].
Bảng 2.3: Trình tự gen Cytb mtDNA của chim yến sử dụng trong nghiên cứu này
Loài Mã số gen Nơi thu mẫu Tài liệu tham khảo
A. salangana AY294424 USA Price và CS, 2004
A. elaphrus AY294430 USA Price và CS, 2004
A. francicus AY294433 USA Price và CS, 2004
Hydrochous gigas AY135625 Hà Lan Thomassen và CS, 2003
A. fuciphagus AY135631 AY135632 Hà Lan Thomassen và CS, 2003 A. fuciphagus EU072052 EU072054 EU072055 EU072061 EU072064 EU085131 EU085129 EU085127
EU085125 EU085123 A. fuciphagus JF269226 JF269227 JF2 69228 JF269229 JF2 69230 JF269231 JF2 69232 JF269233 JF269234 JF269236 Malaysia và Sumatra Goh và CS, 2011