Bảng 3.22: Tỷ lệ xuất hiện HBx-protein trong huyết tương ở các nhóm nghiên cứu Chứng n = 100 NMVR(1) n = 50 VGM (2) n = 50 UTG (3) n = 90 P HBx-protein, n (%) 0 5 (10) 6 (12) 19 (21,1) p1-2>0,05; p1-3,2-3 =0,05
Nhận xét: Tỷ lệ xuất hiện HBx-protein trong huyết tương phổ biến ở
(21% so với 10% và 12%, p=0,05). Trong khi đó nhóm chứng không có trường hợp nào dương tính với HBx.
Bảng 3.23: So sánh sự xuất hiện HBx-protein trong huyết tương ở nhóm ung thư và không ung thư gan.
Không ung thư, n = 100 UTG n = 90 OR (95% CI) P HBx-protein, n (%) 11 (11) 21 (23,3) 5,14 (1,05-6,03) 0,023
Nhận xét: So với nhóm không mắc ung thư gan tần suất xuất hiện HBx-protein trong huyết thanh tăng cao ở nhóm ung thư gan (p=0,023). Sự
xuất hiện HBx-protein trong huyết thanh làm tăng nguy cơ xuất hiện ung thư
cao 5,14 lần so với không xuất hiện HBx-protein trong máu.
3.12.2. Tái tổ hợp và biểu lộ HBx-protein đột biến phân lập từ bệnh nhân UTG.
Gene HBx phân lập từ 4 bệnh nhân UTG tồn tại đồng thời cả chủng HBx đột biến điểm kết hợp với chủng HBx đột biến mất đoạn đầu C-tận. Các
đột biến này được tái tổ hợp trong vector pcDNA3.1 bằng kỹ thuật tách dòng (cloning). Đánh giá vai trò của HBx-protein đột biến liên quan trong bệnh sinh UTG chúng tôi đánh giá tác động của chúng đối với dòng tín hiệu NF- kB trên nuôi cấy tế bào ung thư dòng HepG2. Tế bào HepG2 được chuẩn bị
trên đĩa nuôi cấy 6 giếng. Sau 24 giờ nuôi cấy tế bào HepG2 được chuyển nạp (transfection) các plasmid mang gen HBx đột biến, hoang dại và phối hợp các đột biến giống như thực tế lâm sàng.
48 giờ sau chuyển nạp plasmid HBx vào tế bào cho thấy sự tăng cường phiên mã mạnh mẽ của HBx-gene (HBx-mRNA) và biểu lộ HBx-protein trong tế bào HepG2 (Hình 3.30). Kết quả này chứng minh sự thành công
trong kỹ thuật tách dòng tạo plasmid tái tổ hợp mang gen HBx và biểu hiện HBx-protein trên tế bào ung thư gan dòng HepG2. Đây là kết quả quan trọng tạo tiền đề cho các nghiên cứu tiếp.
Hình 3.27. Biểu hiện HBx-mRNA của HBx-plasmid trên tế bào HepG2. Nhận xét: Có sự khác biệt về mức độ biểu hiện protein giữa các plasmid mang gene HBX đột biến khác nhau. Cột dọc từ trái qua phải (1, 2) chứng âm, (3) HBx-mRNA-wt, (4) HBx-mRNA đột biến mất đoạn, (5) HBx- mRNA đột biến điểm và (6) thang chuẩn DNA.
3.12.3. HBx-protein đột biến và chủng dại tăng cường hoạt hóa NF-kB.
Để chứng minh tương tác của HBx (đột biến và hoang dại) với dòng tín hiệu NF-kB chúng tôi dùng phản ứng luciferase. Kết quả cho thấy 4 chủng
đột biến HBx mất đoạn đầu C-tận phân lập từ bệnh nhân UTG theo thứ tự
HBx-D1, -D2, -D3 đến -D4 gây tăng cường hoạt hóa dòng tín hiệu NF-kB từ
1,39, 4,53, 3,71 và 2,57 lần so với nhóm chứng là những tế bào đáp ứng với vector chứa gen báo cáo NF-kB (Mock, không có HBx). Tuy nhiên, đáp ứng
này của các chủng HBx đột biến mất đoạn (D) đều thấp hơn so với chủng HBx-wt (Hình 3.31). Các chủng HBx đột biến điểm (M) gây tăng cường hoạt hóa NF-kB từ 4 đến 5 lần so với nhóm chứng (p<0,05). Sự hoạt hóa này của các chủng HBx đột biến điểm tương đương nhóm với chủng HBx hoang dại (wt) (p>0,05). Trong khi đó, khi phối hợp cả hai chủng đột biến trên (tương tự như các chủng HBV được phát hiện từ bệnh nhân UTG) cho thấy sự tăng cường hoạt hóa mạnh mẽ dòng tín hiệu NF-kB từ 4,5 đến 6 lần so với chứng (p<0,01) (Hình 3.31).
Hình 3.28. Tăng cường hoạt hóa dòng tín hiệu NF-kB bởi các chủng Nhận xét: HBx (đột biến và wt) thông qua số lần hoạt hóa luciferase so với nhóm chứng (tế bào đáp ứng chỉ với NF-kB đơn thuần, NF- kB+vector, mock). Khả năng hoạt hóa (tính gộp) tăng từ 2,5 đến trên 5 lần so với chứng, theo thứ tự tăng dần từ nhóm tế bào HepG2 đáp ứng với chủng HBx đột biến mất đoạn đầu C-tận (D), đột biến điểm (M), phối hợp cả 2 loại
3.13. Các phương pháp chẩn đoán sớm UTG
Trong thời gian theo dõi từ tháng 5 năm 2008 đến 10/2010 trên 50 bệnh nhân viêm gan B mạn tính và 50 người mang HBV mạn tính chúng tôi không phát hiện được có bệnh nhân nào tiến triển thành UTG. Tuy nhiên chúng tôi thấy có 2/50 (4%) người mang HBV mạn tính không triệu chứng tiến triển thành viêm gan B mạn tính. Phân tích đột biến gene cho thấy cả 2 bệnh nhân này đều có đột biến gene tại vị trí 1762/1764 và 1896/1899 của gene HBV.
Trong số 90 bệnh nhân UTG được theo dõi thì có 10 bệnh nhân đã tử
Chương 4: BÀN LUẬN
Kể từ khi Blumberg phát hiện kháng nguyên HBsAg năm 1963, sau đó Dane tìm thấy hình thể của virut trên kính hiển vi điện tử năm 1970 [73] đến nay đã có hơn 21000 công trình nghiên cứu về virut viêm gan B (HBV). Tuy nhiên, cho đến hiện nay nhiễm HBV vẫn đang là một trong những vấn đề nan giải của y tế toàn cầu. Tỷ lệ nhiễm HBV vẫn cao trên một số khu vực, như Đông Nam Á, trong đó có Việt Nam. Ở nước ta ước tính tỷ lệ nhiễm HBV có giảm theo thời gian nhờ có chương trình tiêm chủng HBV. Tuy nhiên, số
bệnh nhân đã nhiễm HBV vẫn còn lớn, hiệu quảđiều trị các thuốc kháng virut vẫn còn hạn chế và không phải tất cả bệnh nhân đều được tiếp cận đến các phương pháp điều trị hiện đại do ý thức của bệnh nhân còn hạn chế và kinh phí điều trị còn quá cao. Do đó, nguy cơ xuất hiện các biến chứng do nhiễm HBV vẫn chưa có xu hướng dừng lại. Một trong những biến chứng do nhiễm HBV là tiến triển thành ung thư gan (UTG). UTG là một trong 5 loại ung thư
thường gặp và Việt Nam là quốc gia có tỉ lệ người mắc bệnh ung thư gan
đứng hàng thứ 3 trên thế giới. Đặc biệt, tỉ lệ nam mắc bệnh nhiều hơn nữ. Theo “Ghi nhận ung thư quần thể” tại Tp.HCM 2006, ung thư gan đứng hàng thứ 1 ở nam giới với tần suất là 24,2/100.000 dân và đứng hàng thứ 5 ở nữ
giới với tần suất là 6,2 / 100.000 dân. Tại Bệnh viện Ung Bướu Tp.HCM, mỗi năm tiếp nhận khoảng 500 ca ung thư gan mới. Trong những năm gần đây, mỗi năm, Việt Nam có đến 10.000 ca mắc bệnh mới, và trở thành quốc gia có tỉ lệ người mắc bệnh ung thư gan hàng đầu thế giới. Phần lớn các bệnh nhân lại phát hiện bệnh trong giai đoạn muộn nên việc chữa trị không còn hiệu quả (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Do ung thư gan thường đa ổ và đa vị trí nên ngay trong những trường hợp ung thư gan khu trú có phẫu thuật, chỉ khoảng 30-40% bệnh nhân sống
được thêm 5 năm, còn trung bình là khoảng 3 năm.
Một nghiên cứu gần đây dựa trên các số liệu hiện có và sử dụng các thuật toán để tính toán tiên lượng cho thấy tỷ lệ nhiễm HBV mạn tính ở nước ta tăng từ 6.4 triệu người năm 1990 lên khoảng 8.4 triệu năm 2005 và tiên lượng đến năm 2025 là 8 triệu. Kết quả giảm tỷ lệ nhiễm mới HBV như vậy là nhờ có kết quả của chương trình tiêm chủng để phòng nhiễm HBV. Trong khi
đó tỷ lệ xơ gan và UTG do HBV lại có xu hướng tăng cao: năm 1990 là 21.900 đối với xơ gan, 9400 đối với UTG thì đến năm 2025 các số liệu tương
ứng đó là 58.650 và 25.000. Tỷ lệ tử vong do HBV tăng từ 12.600 năm 1990 lên 40.000 ở năm 2025 [11]. Do đó trong những năm tới các bệnh lý về gan như xơ gan và ung thư gan vẫn đang là những vấn đề y tế nan giải. Nhu cầu
để chẩn đoán phát hiện sớm UTG đang hết sức lớn và rất cần kíp hiện nay.
UTG thường được chẩn đoán xác định ở giai đoạn muộn khi có triệu chứng như biểu hiện mệt mỏi, đau bụng, gầy sút cân, thậm chí khi đã có khối khu trú sờđược trên thành bụng, khi có tổn thương tế bào gan hoặc muộn hơn khi không còn khả năng can thiệp phẫu thuật cũng như sử dụng các phương pháp trị liệu khác [3]. Nguyên nhân chẩn đoán UTG muộn là do sự hạn chế về
các phương pháp phát hiện hiện nay. Các phương pháp chẩn đoán UTG đang
được sử dụng tại các cơ sở y tế bao gồm: khám xét lâm sàng phát hiện thấy gan to, đau, gầy sút cân nhanh…, các xét nghiệm máu phát hiện dấu ấn ung thư AFP, siêu âm, X quang, nội soi, chụp cắt lớp vi tính (CT scanner), cộng hưởng từ (Magnetic Resonany Imaging, MRI), sinh thiết gan chẩn đoán mô bệnh học ... Tuy nhiên, tất cả các phương pháp trên thường phát hiện được UTG ở giai đoạn muộn của bệnh, và độ nhạy cũng như độ đặc hiệu vẫn còn
hạn chế [37]. Khi đó các biện pháp can thiệp điều trị ít mang lại hiệu quả, thời gian sống của bệnh nhân sau khi chẩn đoán UTG chỉ kéo dài từ 6 tháng đến 1 năm [38]. Vì vậy, nghiên cứu tìm hiểu các dấu ấn sinh học, các biện pháp chẩn đoán mới để phát hiện sớm và tiên lượng UTG là nhu cầu cần thiết hiện nay.
Kết quả các nghiên cứu trước đây đã chứng minh nhiễm virut viêm gan B (HBV) là nguyên nhân chủ yếu gây UTG. Tuy nhiên không phải tất cả các bệnh nhân nhiễm HBV đều tiến triển thành UTG. Nhiễm HBV có thể gây viêm gan cấp tính tự hồi phục, hoặc tiến triển thành viêm gan mạn tính, xơ
gan, viêm gan ác tính, hoặc trở thành người mang HBV mạn tính không triệu chứng [4]. Nguyên nhân nào dẫn đến sự khác biệt đó vẫn còn nhiều tranh luận. Liên quan đến UTG người ta thấy rất nhiều các bệnh nhân được phát hiện bệnh một cách tình cờ, nghĩa là UTG thường xuất hiện trên các bệnh nhân trước đây hoàn toàn khỏe mạnh nhưng mang HBV mạn tính không triệu chứng.
UTG cũng như tất cả các bệnh ung thư khác nói chung là hậu quả của biến đổi nhiều gene, tương tác qua lại của nhiều protein, DNA trong các tế
bào. Do đặc điểm bộ gene và vòng đời của HBV có liên quan chặt chẽđến sự
hình thành UTG nên việc tìm ra các dấu ấn phân tử của HBV như đột biến gene, mức độ biểu hiện gene HBV và gene người là một trong những hướng nghiên cứu đang rất được quan tâm [4].
Xuất phát từ những cơ sở đó chúng tôi tiến hành nghiên cứu này nhằm tìm ra các dấu ấn phân tử mới để góp phần chẩn đoán sớm UTG trên bệnh nhân nhiễm HBV. Để thực hiện mục tiêu nghiên cứu chúng tôi lựa chọn 3 nhóm bệnh nhân nhiễm HBV (gồm 90 người mang HBV mạn tính không
gan). Để so sánh đối chiếu trong nghiên cứu một số dấu ấn phân tử liên quan cơ thể chủ chúng tôi chọn 100 người khỏe mạnh để làm nhóm chứng. Cơ sở
chúng tôi lựa chọn 3 nhóm bệnh nhân nhiễm HBV như trên là do đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng của nhiễm HBV. Như chúng ta biết nhiễm HBV có thể gây viêm gan B cấp có biểu hiện các triệu chứng điển hình rồi tự hồi phục, hoặc không gây bất kỳ một triệu chứng nào cả, hoặc tiến triển thành viêm gan mạn tính, tiến triển thành xơ gan và ung thư gan, và có một tỷ lệ nhất định thì tiển triển ngay thành viêm gan ác tính, tử vong. Đối với viêm gan B cấp tính xảy ra ở người trưởng thành thì hơn 95% là phục hồi hoàn toàn, HBsAg trở về
âm tính sau thời gian 3-6 tháng. Trong khi đó nếu nhiễm HBV trong giai đoạn chu sinh, hoặc lây từ mẹ sang con thì hầu hết diễn biến âm thầm, hơn 90% trở
thành nhiễm HBV mạn tính.
Việt nam là một trong những nước có hình thức lây nhiễm HBV từ mẹ
sang con cao nhất. Do đó, hầu hết bệnh nhân nhiễm HBV đều có thời gian mang mầm bệnh từ rất lâu trước khi phát hiện được. Thực tế các nghiên cứu trước đây cho thấy Việt nam là nước nằm trong khu vực có tỷ lệ nhiễm HBV cao nhất với tỷ lệ nhiễm ở nhũ nhi là 12.5%, trẻ em (18.4%), thanh thiếu niên (20.5%), và người lớn là 18.8%. Đặc biệt tỷ lệ đã từng nhiễm HBV ở người lớn lên tới 79.2% [5].
Các nghiên cứu trước đây đã cho thấy có 15-40% bệnh nhân viêm gan B mạn tính tiến triển thành xơ gan và UTG. Tuy nhiên, khi đã bị xơ gan thì các triệu chứng tương đối điển hình, dễ được chẩn đoán và theo dõi như có hội chứng suy chức năng gan và hội chứng tăng áp lực tĩnh mạch cửa. Nguy cơ tiến triển thành UTG trên những bệnh nhân xơ gan đã được xác định là rất cao. Đối với những bệnh nhân này họ thường được điều trị và theo dõi chặt chẽ trong những điều kiện phù hợp.
Trong khi đó trên những người nhiễm HBV không triệu chứng, và ngay cả trên những bệnh nhân viêm gan B mạn tính thì không phải luôn được chẩn
đoán kịp thời. Hầu hết các bệnh nhân được chẩn đoán một cách tình cờ. Nhiều bệnh nhân khi được chẩn đoán là UTG thì mới biết mình bị nhiễm HBV. Một trong những lý do để bệnh nhân không thực sự quan tâm đến việc kiểm tra sức khỏe định kỳ là hiện tại y học chưa tìm ra được những những yếu tố nguy cơ, dấu ấn phân tử đủ độ tin cậy để dự báo sự xuất hiện ung thư trên những bệnh nhân đó. Vì vậy, người ta có thói quen là phó mặc cho số phận, coi như
nhiễm HBV cũng là ngẫu nhiên. Khi đã nhiễm HBV thì tiến triển như thế nào cũng chưa biết, bởi vì các nhà khoa học, các Bác sỹ cũng không dám chắc khi dự đoán tiến triển bệnh do còn thiếu các cơ sở khoa học. Do đó họ chỉ biết cầu nguyện mình không tiến triển thành ung thư…
Thực tế nghiên cứu tại Ý, một nước công nghiệp phát triển cũng cho thấy không phải bệnh nhân nào cũng có thể biết tương lai của mình khi nhiễm HBV. Đồng thời kết quả nghiên cứu lại ủng hộ những quan điểm phòng bệnh thụ động, phó mặc cho số phận. Trong nghiên cứu đó người ta đã tiến hành theo dõi 296 người khỏe mạnh phát hiện nhiễm HBV khi đi hiến máu, thời gian theo dõi được tiến hành trong 30 năm. Khi so sánh nguyên nhân và tỷ lệ
tử vong với quần thể bình thường không nhiễm HBV người ta thấy: không có sự khác biệt về tỷ lệ tử vong giữa 2 nhóm (10.8% so với 8.9%, P = 0.625); nguyên nhân tử vong do các bệnh gan cũng không có sự khác biệt (9.3% so với 7.1%), nguyên nhân gây tử vong do UTG cũng tương đương giữa 2 nhóm (0.6% trên mỗi nhóm). Một kết quả rất đáng phấn khởi là có tới 32.2% trường hợp chuyển đảo huyết thanh HBsAg, với tỷ lệ hằng năm là 1% [74].
Từ những cơ sở đó chúng tôi lựa chọn 2 nhóm bệnh nhân nhiễm HBV là NMVR và VGM để tìm hiểu các dấu ấn phân tử mới giúp tiên lượng chẩn
đoán sớm UTG. Nhóm UTG được sử dụng trong nghiên cứu này được xem như là một nhóm chứng dương, còn nhóm người khỏe mạnh được xem là nhóm chứng âm. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
4.1. Đặc điểm chung các nhóm nghiên cứu
4.1.1. Đặc điểm về tuổi và giới
Cũng tương tự như các nghiên cứu trước đây trong nghiên cứu này chúng tôi thấy chủ yếu là bệnh nhân nam chiếm 82.63% và chỉ có 17.37% là bệnh nhân nữ. Tuy nhiên, giữa các nhóm không có sự khác biệt về tỷ lệ
nam/nữ. Có thể do số lượng bệnh nhân của chúng tôi còn ít nên chưa thể kết luận được về mối liên quan giữa giới tính với mức độ tiến triển thành UTG trên những bệnh nhân nhiễm HBV. Mặc dù các nghiên cứu trước đây đã chứng minh có sự liên quan giữa giới tính nam với UTG. Trong các nghiên cứu đó người ta thấy UTG do nhiễm HBV thường gặp trên các bệnh nhân nam hơn là bệnh nhân nữ. Bệnh nhân nam thường có nồng độ HBV DNA tăng cao hơn bệnh nhân nữ, mà HBV DNA là một yếu tố nguy cơ phát triển