đoán UTG tại Việt Nam
Có nhiều nghiên cứu về UTG hiện nay ở Việt Nam, tuy nhiên các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào tỷ lệ mắc, các phương pháp can thiệp điều trị, đặc biệt là các phương pháp điều trị ít xâm lấn đã mang lại những hiệu quả
nhất định.
Gần đây đánh giá giá trị chẩn đoán sớm UTG bằng siêu âm kết hợp siêu âm doppler màu chúng tôi thấy đây là một phương pháp chẩn đoán hình
đặc hiệu 82,4% tuy nhiên nếu so sánh với AFP> 500 ng/ml thì độ đặc hiệu thấp hơn AFP. Gần đây Khiên VV và Cs đã sử dụng AFP-L3 (AFP ái lực với Lectin) trong chẩn đoán UTG cho kết quả độ nhạy, độ đặc hiệu và tỷ lệ dự
báo của test dương tính tương ứng là 96,9%, 92% và 95,5%. Marker AFP-L3 có thể sử dụng để phân biệt và chẩn đoán sớm UTG ở những bệnh nhân viêm gan mạn tính có AFP huyết thanh tăng nhẹ [44]. Tuy nhiên do khó khăn về
mặt kỹ thuật và giá thành nên AFP-L3 chưa được áp dụng phổ biến trong chẩn đoán ở nước ta.
Chìa khoá thành công của can thiệp điều trị UTG phụ thuộc rất nhiều vào thời gian phát hiện bệnh sớm hay muộn. Trong khi các phương pháp chẩn
đoán hiện nay thường chỉ phát hiện được ở giai đoạn muộn. Mặc dù còn tương đối mới mẻ ở Việt Nam, các kỹ thuật sinh học phân tử đang được áp dụng ngày càng nhiều vào chẩn đoán và theo dõi điều trị các bệnh lý do vi sinh vật, tổn thương di truyền... gây ra, đặc biệt là các bệnh lý do HBV, HCV, HIV. Tuy nhiên trong lĩnh vực ung thư, chưa có nghiên cứu nào công bố áp dụng các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại để chẩn đoán sớm và tiên lượng bệnh nhân UTG nói chung và nhiễm HBV nói riêng. Đặc biệt là các nghiên cứu vềđột biến gene và giá trị của chúng trong chẩn đoán và tiên lượng UTG.
Gần đây trong một số công trình nghiên cứu của chúng tôi tiến hành ở
Cộng hoà liên bang Đức về liên quan của đột biến gene (đột biến MBL, HBX, IFN-alfa 2 promoter) với các thể lâm sàng viêm gan virut B [54], [70], [71], cũng như tác động của kiểu gene của HBV và đồng nhiễm HBV/Parvovirut B19 trên quá trình bệnh lý gan [31], [72]. Trong những nghiên cứu này bước
đầu thu được một số kết quả nhất định như giải thích được phần nào mối liên quan của đột biến gene với bệnh cảnh lâm sàng bệnh lý gan cũng như bệnh sinh UTG. Tuy nhiên, đây chỉ là những nghiên cứu liên quan trong bệnh sinh của bệnh lý gan do HBV mà chưa có các nghiên cứu ứng dụng khác. Vì vậy, nghiên cứu ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại trong chẩn đoán sớm và tiên lượng bệnh nhân UTG nhiễm HBV đóng vai trò quan trọng và cần thiết góp phần nâng cao hiệu quả điều trị và kéo dài thời gian sống của
Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Đối tượng
Tổng số có 190 bệnh nhân được chia thành 3 nhóm:
- Ung thư gan: 90 bệnh nhân và được chia thành 3 nhóm nhỏ: 30 bệnh nhân ung thư gan có kích thước khối u < 2cm; 30 bệnh nhân ung thư
gan có kích thước khối u từ 2-5 cm; và 30 bệnh nhân có kích thước khối u > 5cm.
- Viêm gan B mạn tính: 50 bệnh nhân
- Người mang HBV mạn tính không triệu chứng: 50 bệnh nhân
Để so sánh một số gene người chúng tôi lấy 100 người khỏe mạnh làm nhóm chứng.
2.1.1. Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân ung thư gan
- Lâm sàng: bệnh nhân mệt mỏi ăn uống kém, gầy sút cân nhanh. Có thể có các triệu chứng khác như gan to dưới bờ sườn, bờ sắc mật độ chắc, có u cục lổn nhổn nổi trên bề mặt đau khi thăm khám.
- Xét nghiệm: AFP tăng cao, Bilirubin trực tiếp và gián tiếp có thể tăng, AST, ALT hoặc phosphataza kiềm tăng. Siêu âm phát hiện khối tăng âm khư trú hoặc lan tỏa. Chụp CT hoặc MRI xác định vị trí kích thước khối u. Sinh thiết gan xét nghiệm làm tế bào học hoặc/và mô bệnh học cho kết quả xác định có UTG và mức độ biệt hoá kèm theo. Xét nghiệm huyết thanh có HBsAg (+).
2.1.2. Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân viêm gan B mạn tính
- Bệnh nhân đã được xác định có HBsAg (+) sau thời gian > 6 tháng.
- Các triệu chứng lâm sàng và cận lâm sàng có biểu hiện tổn thương mô gan. Hiện tại có biểu hiện lâm sàng viêm gan như mệt mỏi, chán ăn, gan to dưới bờ
cao hơn 2 lần bình thường, Bilirubin máu và nước tiểu có thể bình thường hoặc tăng.
- Sinh thiết gan làm mô bệnh học cho thấy hình ảnh viêm gan mạn tính.
2.1.3. Tiêu chuẩn lựa chọn người mang HBV mạn tính không triệu chứng
- Tiền sử và hiện tại chưa bị viêm gan bao giờ.
-Tình cờ phát hiện có HBsAg (+) qua các đợt khám sức khỏe định kỳ. - Hiện tại AST/ALT, Bilirubin trong giới hạn bình thường.
2.1.4. Tiêu chuẩn loại trừ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Những người có Anti HIV (+), Anti HCV (+), có tiền sử và bằng chứng nhiễm Aflatoxin.
- Ung thư cơ quan khác di căn gan.
- Các bệnh nhân có tiền sử và hiện tại điều trị các thuốc kháng virut hoặc Interferon.
2.1.5. Địa điểm lấy mẫu
- Bệnh nhân viêm gan B mạn tính được thu thập tại Khoa Truyền nhiễm Bệnh viện TƯQĐ 108.
- Bệnh nhân ung thư gan được thu thập tại Khoa Tiêu hóa, Bệnh viện TƯQĐ
108 và Khoa Tiêu hóa, Bệnh viện Bạch Mai.
- Người mang HBV mạn tính không triệu chứng được theo dõi hồ sơ tại Khoa Sinh học phân tử, Bệnh viện TƯQĐ 108.
2.2. Phương pháp
Nghiên cứu được tiến hành theo phương pháp tiến cứu, mô tả, theo dõi dọc.
2.2.1. Thu thập bệnh nhân và số liệu nghiên cứu
- Tất cả các bệnh nhân sau khi đảm bảo các tiêu chuẩn nghiên cứu được thu thập hồ sơ theo mẫu thống nhất.
- Các thông số về huyết học, sinh hóa, miễn dịch, Xquang, siêu âm và sinh học phân tửđược theo dõi đăng kí đầy đủđịnh kỳ sau mỗi 6 tháng.
2.2.2. Thu thập mẫu bệnh phẩm
- Tất cả các bệnh phẩm phục vụ các chẩn đoán thường quy như huyết học, sinh hóa, miễn dịch...thì được tiến hành theo quy định tại Bệnh viện.
- Nhóm viêm gan mạn tính được sinh thiết gan 1 lần khi vào viện. Kỹ thuật
được tiến hành tại Khoa Truyền nhiễm Bệnh viện TƯQĐ 108. Mẫu bệnh phẩm được gửi lên Khoa Giải phẫu bệnh để tiến hành các xét nghiệm mô bệnh học và hóa mô miễn dịch.
- Nhóm ung thư gan được sinh thiết gan 1 lần khi vào viện lần đầu. Kỹ thuật
được tiến hành tại Khoa Tiêu Hóa. Mẫu bệnh phẩm được gửi lên Khoa Giải phẫu bệnh để tiến hành các xét nghiệm mô bệnh học và hóa mô miễn dịch. - Tất cả các bệnh nhân được lấy máu 2 lần (tại thời điểm khi đưa vào nghiên cứu và khi kết thúc nghiên cứu) để gửi về Khoa Sinh học phân tử. Tại Khoa sinh học phân tử các xét nghiệm về gene, protein đã được tiến hành
Nhận xét: bệnh nhân được theo dõi các chỉ tiêu trong một mẫu thống nhất, bên cạnh đó, ngay từ khi đưa vào nghiên cứu và cứ sau mỗi 6 tháng thì đều
được lấy thêm các mẫu máu để lưu giữ tại Khoa sinh học phân tử. Từ đó sẽ
tách chiết DNA, RNA để chuyển tới các phòng xét nghiệm của Học viện quân y, Đại học y Hà Nội, Viện Công nghệ sinh học.
Hình 2.2. Các thời điểm thu thập bệnh phẩm
Chú thích: Tính đến tháng 12 năm 2008 chúng tôi thu thập được 150 bệnh nhân lần 1, đến tháng 6/2009 chúng tôi thu thập thêm được 40 bệnh nhân nữa. Tại thời điểm tháng 6 năm 2009 150 đầu tiên được theo dõi lần thứ 2. Đến tháng 12 năm 2009 150 bệnh nhân đầu tiên được theo dõi lần 3, 40 bệnh nhân theo dõi lần 2. Đến tháng 6 năm 2010 thì có 150 bệnh nhân được theo dõi lần 4 và 40 bệnh nhân được theo dõi lần 3. Hiện tại chúng tôi đang tiếp tục theo dõi những bệnh nhân này. Như vậy, tính đến tháng 6 năm 2010 thì trong số
190 bệnh nhân theo dõi được 3 lần thì có 150 bệnh nhân được 4 lần theo định kỳ 6 tháng. Kí hiệu: AFP = alpha feto protein; HMMD = hóa mô miễn dịch; MBH = mô bệnh học; BN L1....5 = bệnh nhân được theo dõi lần 1....5.
12/08 12/096/09 6/10 10/10 BN 15 19 BN 19 15 15 BN 19 BN 15 BN 15 + MBH HMMD 90 50 90 50 AFP 15 78 53 AFP 19 19
2.2.3. Định lượng nồng độ HBV DNA
HBV DNA được tách chiết bằng bộ kit DNA extraction của Qiagen. Các bước được tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
HBV DNA được định lượng bằng kỹ thuật Real time PCR trên hệ thống Realtime PCR ABI 7500 (Mỹ). Chúng tôi đã áp dụng nguyên lý Hydrolysis Probe (TaqMan Probe) để phát hiện sản phẩn PCR. Nguyên lý này như sau:
Phản ứng Real time sử dụng TaqMan Probe được thiết kế gồm: Một bộ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
mồi đặc hiệu và một chuỗi oligonucleotide (Probe) có trình tự bổ sung với
đoạn trình tự khuôn nằm giữa hai mồi.
Mẫu dò oligonucleotide được thiết kế với đầu 5’ gắn chất phát tín hiệu huỳnh quang (Reporter) và đầu 3’ gắn một chất kìm hãm sự phát tín hiệu huỳnh quang phát ra từ Reporter được gọi chung là Quencher. Mẫu dò này ở
trạng thái nguyên vẹn (không bị phân hủy), ở trạng thái bình thường (không bị kích hoạt) thì toàn bộ năng lượng phát ra từ Reporter được truyền sang Quencher khiến cho Reporter không phát được tín hiệu huỳnh quang mà chỉ
có Quencher phát được, nhưng máy chủ sẽ không nhận được tín hiệu vì hệ
thống kính lọc không phù hợp với bước sòng phát ra từ Quencher.
Khi phản ứng PCR diễn ra, mẫu dò sẽ bắt cặp bổ sung vào DNA khuôn sau đó bị phân cắt bởi hoạt tính 5’exonucleaza của TaqDNA polymerase trong quá trình tổng hợp chuỗi. Chính nhờ sự phân cắt này làm cho Reporter
được giải phóng khỏi Quencher để phát tín hiệu huỳnh quang, đồng thời loại bỏ mẫu dò khỏi khuôn DNA cho phép kéo dài tiếp sản phẩm PCR. Reporter bị phân cắt khỏi khuôn DNA sau mỗi chu kỳ của phản ứng PCR có nghĩa là tín hiệu huỳnh quang thu được sẽ tỷ lệ với sự nhân lên của sản phân PCR (Hình 2.3).
Hình 2.3. Nguyên lý phản ứng định lượng Real-time PCR sử dụng mẫu dò TaqMan
Dựa vào nguyên lý trên chúng tôi đã thiết kế một cặp mồi trong vùng bảo tồn của gen S của HBV và mẫu dò oligonucleotide có đầu 5’(Reporter) mang hợp chất phát mầu FAM và đầu 3’(Quencher) mang hợp chất TAMRA
để định lượng nồng độ HBV DNA (bảng 2.1), phản ứng định lượng được chuẩn bị với thành phần như bảng 2.2.
Bảng 2.1: Trình tự bộ mồi định lượng HBV DNA Real-time PCR
Tên primer Trình tự HBs F 5´-CA.ACCTCCA.ATCACTCACCA.AC-3´ HBs R 5´-ATATGATA.AA.ACGCCGCAGACACA-3´ HBs-Taq 5´- (FAM)TCCTCCA.ATTTGTCCTGGTTATCGCT(TAMRA)- 3´
Bảng 2.2: Thành phần phản ứng Real-time PCR
Thành phần Thể tích
Master mix PCR2X (ABI) 10µl
HBsF (15pM) 0,5µl HBsR (15pM) 0,5µl HBs-Taq (5pM) 0,5µl H2O 3,5µl HBV DNA 5µl Tổng thể tích phản ứng 20µl
Phản ứng định lượng tiến hành theo chu trình nhiệt được thiết lập trên hệ
thống Realtime ABI 7500:
500C --- 5 phút 940C ---1 phút
940C --- 15 giây 45 chu kỳ
600C --- 1 phút
Nồng độ DNA của virus HBV sẽđược định lượng dựa trên cường độ của các tín hiệu huỳnh quang và một bộ chuẩn đối chứng.
Phương pháp này cho phép định lượng chính xác nồng độ của HBV – DNA (số copies/ml). Đồng thời cho biết nồng độ của đoạn gene đích ngay trong từng thời điểm quan tâm (Hình 2.4).
Hình 2.4. Biểu diễn kết quả của xét nghiệm HBV DNA real time PCR.
Giải thích: Hình trên cho biết đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang của các mẫu đo và đường chuẩn để tính toán nồng độ HBV DNA. Mỗi lần xét nghiệm chúng ta luôn phải chạy song song các mẫu chuẩn đã biết nồng độ để xây dựng đường chuẩn.
2.2.4. Phương pháp xác định kiểu gene HBV
Cơ sở của việc sử dụng kỹ thuật PCR-RFLP để xác định kiểu gen HBV
đó chính là sự khác biệt trong trình tự vùng mã hóa gen Core giữa các kiểu gen của HBV. Với hầu hết các kiểu gen của HBV, chiều dài của bộ gen trung bình khoảng 3221bp, trong đó vùng mã hóa gen Core được định vị từ nt 1903
đến nt 2458. So sánh trình tự các nucleotide vùng này giữa các kiểu gen khác nhau của HBV chúng tôi nhận thấy: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Có các vị trí nhận biết khác nhau của enzym giới hạn Tsp905I
- Kiểu gen G có sự chèn của 36 nt vào vị trí từ nt 1906 đến nt 1941 so với bảy kiểu gen còn lại (A, B, C, D, E, F, H)
- Kiểu gen A có sự chèn thêm 6 nt vào vị trí từ nt 2360 đến nt 2365 so với bảy kiểu gen còn lại (B, C, D, E, F, G, H)
Dựa trên những quan sát trên chúng tôi thiết kế các cặp mồi đặc hiệu có trình tự như bảng 4.
Bảng 2.3: Trình tự các bộ mồi đặc hiệu cho vùng Core HBV
Tên mồi Trình tự Kích thước (nt) Tm (0C) HBPre-Core F 5’-AGTTGGGGGAGGAGATTAGGT- 3’ 21 53 HBx-core R 5’-TTTCCCACCTTATGAGTCCA.A-3’ 21 50 HBcore F 5’- CA.AGCCTCCA.AGCTGTGCCTTGG GTGGCCTT-3’ 31 68 HBcore-A R 5’- TTCTTCTTCTAGGGGACCTGCCTC GGTCCCG-3’ 31 66 HBcore-noA R 5’- TTCTTCTTCTAGGGGACCTGCCTC GTCGTCT-3’ 31 64 Phản ứng PCR sử dụng cặp mồi HBcore F/ HBcore-A,R (cặp mồi A) sẽ
khuyếch đại vùng Core của kiểu gen A và cho sản phẩn có kích thước 520bp. Phản ứng PCR với cặp mổi HBcore F/ HBcore-noA,R (cặp mồi noA) sẽ
khuyếch đại vùng Core của các kiểu gen không phải là A (bảy kiểu gen còn lại). Sản phẩn PCR nếu có kích thước là 550bp, xác định HBV DNA khuôn thuộc kiểu gen G. Nếu sản phẩm PCR có kích thước 514bp, xác đinh HBV DNA khuôn thuộc sáu kiểu gen còn lại (B, C, D, E, F, H), và để xác định HBV DNA khuôn đó thuộc kiểu gen nào trong số 6 kiểu gen còn lại đó cần tiến hành phản ứng cắt RE Tsp509I.
Cặp mồi HbPre-CoreF/ HBx-core R được xem như bộ mồi bổ trợ. Đối với các mẫu có nồng độ HBV DNA thấp <105, khi nhân trực tiếp hai cặp mồi trên sẽ khó có khả năng phát hiện sản phẩm PCR trên bản gel điện di, do đó cần tiến hành chạy nested PCR bằng cặp mồi ngoài là HbPre-Core/ FHBx- core R. Sản phẩn PCR của cặp mồi này có kích thước 742bp, sau đó sẽđược làm khuôn cho hai cặp mồi A và noA (hình 2.5).
Hình 2.5: Nguyên lý PCR lồng áp dụng cho đoạn trình tự Core Phản ứng PCR
Các hóa chất cho phản ứng PCR đều do hãng Fermentas cung cấp. HBV DNA sau khi được tách từ khối huyết thanh của bệnh nhân và có kết quảđịnh lượng đạt yêu cầu sẽ được tiến hành khuyếch đại với các bộ mồi như trên bằng máy ABI 9700 (Mỹ).
Phản ứng PCR cặp mồi HBcore F/ HBcore-A,R và HBcore F/ HBcore- noA,R chạy cùng một chu trình nhiệt độ:
940C --- 5 phút 940C ---30 giây 600C --- 30 giây 35 chu kỳ 720C --- 30 giây 720C --- 10 phút 40C --- ∞