Để khảo sát đột biến gene INFAR1 tại điểm 17470 (G→C) chúng tôi sử dụng các cặp mồi: 5’-CTTTCCCTGTAGTAGTGGTTCT-3’ (IFNAR-F1) và 5’-CTGTAGTGAGCCGTGATTGT-3’ (IFNAR-R1), (Qiagen,
Germany).
Sản phẩm tạo ra có kích thước 420-base pair (bp). Phản ứng được tiến hành trong 50 µL chứa Taq DNA polymerase (0.5 units); 0.2 µM của mỗi mồi; 2.5 mM MgCl2; 2 µM 0.4 µL dNTP và H2O vừa đủ.
Chu trình nhiệt: 950C --- 5 phút 950C ---30 giây 600C --- 30 giây 35 chu kỳ 720C --- 30 giây 720C ---10 phút 40C --- ∞
Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng chạy điện di trên thạch agarose. Tiếp theo tiến hành các phản ứng cắt enzyme theo phương pháp PCR RFLP sử dụng enzyme BsmAI ủở 55oC trong 1 giờ (New England Biolabs). BsmAI cắt sản phẩm PCR từ 420 bp thành 2 mảnh 359bp và 61bp. Sau khi cắt enzyme sẽ kiểm tra bằng chạy điện di trên thạch 3% nhuộm Ethidium bromide và soi dưới kính có đèn cực tím.
Để phân tích gene IFNAR1 tại vị trí Leu168Val chúng tôi sử dụng cặp mồi: 5’-AGCTTTCTATCCTATCTGTATG- 3’ (IFNAR-F2) và 5’-TTCGCC TAATTTTTCTCT-3’ (IFNAR-R2). Quy trình phản ứng giống như mô tả
trên, ngoại trừ nhiệt độ gắn mồi có khác là 54oC trong 30 giây. Sản phẩm PCR có kích thước là 345 bp. Sau đó được cắt bằng enzyme DdeI theo hướng dẫn của nhà sản xuất (New England Biolabs). Sản phẩm tạo ra là 3 đoạn có kích thước 60bp, 78bp và 207bp. Nếu có đột biến thì sẽ cho 2 đoạn có kích thước 86bp và 121bp.