Máu tĩnh mạch của bệnh nhân được lấy vào hai thời điểm: ngay khi tham gia nghiên cứu và tháng thứ 18 theo dõi. Các mẫu máu được giữ trong các ống chống đông chứa sẵn EDTA. Các tế bào đơn nhân máu ngoại vi được thu lại bằng ly tâm gradient trọng lực Ficoll-Hypaque.
- Tách chiết RNA và tổng hợp cDNA: RNA tổng số được tách từ các tế bào
đơn nhân máu ngoại vi bằng phương pháp Trizol Reagent (Invitrogen, Mỹ) theo quy trình của nhà sản xuất. Chất lượng và khối lượng RNA được đánh giá bằng điện di trên máy Agilent. Phản ứng phiên mã ngược tổng hợp cDNA
được tiến hành bằng kit tổng hợp cDNA (Invitrogen, Mỹ) theo quy trình của nhà sản xuất. cDNA được giữở -200C cho nghiên cứu tiếp theo.
- Định lượng AFP mRNA: Định lượng mRNA của gene mã hóa AFP đặc hiệu ung thư gan được tiến hành bằng định lượng tương đối (Relative Quantification) với Real-time PCR. Để kiểm soát độ chính xác của phương pháp cũng như lượng mRNA đưa vào ban đầu trong các mẫu của phản ứng real-time PCR, ngoài việc định lượng mRNA của gen AFP chúng tôi định lượng song song cả “housekeeping gene” β-actin. Nguyên lý sử dụng là định lượng tương đối bằng Real-time PCR sử dụng TaqMan probe (Pfaffl, 2001).
Các mồi và probe sử dụng trong nghiên cứu có trình tự như sau:
Tên Trình tự
AFP forward primer 5’-TGAAGAGGGAAGACATAACTG-3’ AFP reversed primer 5’-AGCAGCCCAAAGAAGAAT-3’
AFP TaqMan Probe 5’-FAM-ACACAAAAAGCCCACTCCAGC-TAMRA-3’
β-actin forward primer 5’-GATGGCCACGGCTGCTT-3’
β-actin reversed primer 5’-ACCCTCATTGCCAATGGT-3’
β-actin TaqMan Probe 5’-VIC-CTACGAGCTGCCTGACGGCCAGG-TAMRA-3’
Phản ứng PCR được tiến hành trên hệ thống LightCycler 2.0 (Roche), khuếch đại đồng thời cả HS AFP-mARN và β-actin mARN trong cùng một
ống phản ứng sử dụng 5µl cDNA, 1 µl mồi và probe mỗi loại, 4 µl Master Mix trong tổng thể tích phản ứng là 20 µl. Phản ứng tiến hành theo quy trình PCR hai bước: bước 1: biến tính cDNA (950C trong 5 phút); bước 2: 40 chu kỳ lặp lại (950C trong 30 giây, 660C trong 1 phút). Dữ liệu được phân tích bằng phần mềm LightCycler 4.0 (Roche). Sau khi định lượng đồng thời cả
AFP mRNA và β-actin thì sẽ phân tích kết quả dự trên tỷ lệ sau trên từng bệnh nhân: Lượng AFP-mARN trong mẫu/Lượng β-actin-mARN trong mẫu. Tỉ lệ này thể hiện mức độ biểu hiện AFP-mARN trong mẫu và qua đó phản ánh sự có mặt của các tế bào u gan đang lưu hành trong máu ngoại vi.