Mức độ biểu hiện gen mRNA GP73 được đánh giá bằng việc sử dụng phương pháp Real Time PCR SYBR Green (Applied Biosystems, Mỹ). RNA tổng số được tách từ máu theo hướng dẫn của nhà sản xuất bằng QIAamp RNA blood Mini Kit (Qiagen, Mỹ). RNA tổng số sau khi được tách sẽ được
sử dụng để thực hiện phản ứng phiên mã ngược RT-PCR bằng M-MLV Reverse Transcriptase (Promega, Mỹ). Sản phẩm cDNA sau đó được cất ở tủ
-20oC cho đến khi định lượng bằng Real Time PCR.
Để xác định mức độ biểu hiện của GP73, chúng tôi sử dụng phương pháp so sánh nội chuẩn từng cặp gene chạy đồng thời GP-73 và GAPDH. Nguyên lý là do khi tách chiết RNA của từng mẫu sẽ không giống nhau, vì ở
các thời điểm khác nhau do đó nếu không có gene nội chuẩn để so sánh thì sẽ
cho kết quả không chính xác. Gene nội chuẩn GAPDH là một gene luôn biểu hiện ổn định trong tất cả các mô, tế bào, do đó người ta thường sử dụng gene này để so sánh đối chứng. Các cặp mồi được sử dụng trong nghiên cứu này là:
GP73-F: 5’-CAGCGCTGATTTTGAGATGA-3’
GP73-R: 5’-ATGATCCGTGTCTGGAGGTC-3’ cho gene GP-73. Mồi cho gene nội chuẩn GAPDH:
GAPDH – F: 5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3’ GAPDH – R: 5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’ Thành phần phản ứng Real time PCR:
Thành phần phản ứng Thể tích
2X SYBR Green PCR master mix 25 µl
Mồi – F 1.25 µl
Mồi – R 1.25 µl
Sản phẩm cDNA 5 µl
H2O 17.5 µl
Phản ứng tiến hành theo chu trình nhiệt được thiết lập trên hệ thống máy Real-time ABI 7500: 95oC – 10 phút; 45 chu kỳ (95oC – 15 giây, 60oC – 1 phút).
Mức độ biểu hiện mRNA GP73 được xác định dựa trên việc so sánh
đánh giá cường độ của các tín hiệu huỳnh quang và nội chuẩn GAPDH. Cụ
thể là tính toán tỷ lệ chu kỳ (Ct) giữa GAPDH và GP-73.