GSTP1 đã được định lượng trong huyết tương bằng công nghệ Real Time PCR trên hệ thống máy Real time – PCR ABI 7500 (Applied BioSystem, Mỹ). Quy trình tóm tắt như sau: huyết tương của bệnh nhân được thu hồi sau khi lấy máu toàn bộ 4 giờ. DNA tổng số được tách chiết bằng Kit Qiagen theo quy trình của nhà sản xuất. cfDNA (GSTP1) được nhân lên bằng cặp mồi: SGTP1 F: 5’-ACC CCA GGG CTC TAT GGG AA-3’ và SGTP1 R: 5’-TGA GGG CAC AAG AAG CCC CT-3’. Và được nhận biết bằng Prob theo trình tự sau: SGTP1 Probe: FAM-GAC ATG GTG AAT GAC GGC GTG T-TAMRA. Nguyên lý sử dụng các mẫu dò (Probe) theo phương pháp Taqman. Đây là phương pháp đặc hiệu nhất hiện nay so với các phương pháp sử dụng trong Real Time PCR khác. Bình thường chất TAMRA sẽ ức chế sự
phát sáng của chất FAM. Khi có đoạn DNA đặc hiệu với probe thì probe sẽ
gắn vào và đoạn TAMRA sẽ tách ra và giải phóng FAM, do đó FAM phát sáng và máy sẽ đo cường độ ánh sáng mà biết chính xác số copies có trong mẫu theo thời gian.
2.2.14. Phương pháp hóa mô miễn dịch
Nguyên lý của phương pháp Hóa mô miễn dịch là sử dụng kháng thể đặc hiệu để phát hiện kháng nguyên trên bề mặt mô. Phức hợp gắn kết kháng
Bước 1: Cốđịnh mô và bảo quản trong Paraffin Bước 2: Cắt bệnh phẩm
Bước 3: Loại bỏ Paraffin và nước Bước 4: Phục hồi kháng nguyên Bước 5: Nhuộm hóa mô miễn dịch
Bước 6: Loại bỏ nước và bình ổn bằng dung môi Bước 7: Kiểm tra kết quả nhuộm dưới kính hiển vi Cụ thể các bước được tiến hành như sau:
¾ Nguyên vật liệu và hóa chất
- Xylene
- Ethanol, anhydrous denatured, histological grade (100% và 95%) - Deionized water (dH2O)
- Hematoxylin
- Wash Buffer: 1X TBS/0.1% Tween-20 (1X TBST), 10X Tris Buffered Saline (TBS).
- TBST/5% normal goat serum
- PBST/5%: 1X PBS/0.1% Tween-20 (1X PBST); 10X Phosphate Buffered Saline (PBS).
- Antigen Unmasking: Citrate, EDTA, TE, Pepsin. - 3% Hydrogen Peroxide.
- Blocking Solution.
- Biotinylated secondary antibody. - ABC Reagent. - DAB Reagent. ¾ Loại bỏ Paraffin và nước - Ủ mảnh tổ chức 3 lần, mỗi lần 5 phút trong Xylene. - Ủ mảnh tổ chức 2 lần, mỗi lần 10 phút trong cồn 100%. - Ủ mảnh tổ chức 2 lần, mỗi lần 10 phút trong cồn 95%.
- Rửa 2 lần với nước sạch, mỗi lần trong 5 phút.
¾ Bộc lộ kháng nguyên
- Đun sôi slide trong dung dịch sodium citrate 10 mM, pH 6.0 sau đó duy trì ở nhiệt độ gần sôi khoảng 10 phút, làm lạnh slide trong 30 phút.
¾ Nhuộm
- Rửa 3 lần, mỗi lần 5 phút bằng nước sạch - Ủ hydrogen peroxide 3% trong 10 phút - Rửa 2 lần, mỗi lần 5 phút bằng nước sạch - Rửa 5 phút bằng dung dịch rửa
- Thêm 100-400 µl blocking solution trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng
- Loại bỏ dung dịch block và thêm 100-400 µl kháng thể đầu (primary antibody), ủ qua đêm ở 4°C
- Loại bỏ kháng thể và rửa 3 lần, mỗi lần 5 phút bằng dung dịch rửa - Thêm 100-400 µl biotinylated secondary antibody. Ủ 30 phút ở nhiệt
độ phòng
- Chuẩn bị dung dịch ABC và ủở nhiệt độ phòng 30 phút
- Loại bỏ kháng thể thứ 2 và rửa 3 lần, mỗi lần 5 phút bằng dung dịch rửa
- Thêm 100-400 µl ABC và ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng
- Loại bỏ dung dịch ABC và rửa 3 lần, mỗi lần 5 phút bằng dung dịch rửa (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Thêm 100-400 µl DAB và theo dõi sự chuyển màu - Ngay khi có chuyển màu thì nhúng slide vào trong nước - Rửa bằng nước sạch 2 lần, mỗi lần 5 phút
¾ Loại bỏ nước
- Ủ trong cồn 95% 2 lần, mỗi lần 10 giây - Ủ trong cồn 100% 2 lần, mỗi lần 10 giây
- Phủ slide
2.2.15. Phương pháp nghiên cứu chức năng của đột biến gen HBx phân lập từ bệnh nhân UTG
2.2.15.1. Chế tạo các plasmid HBx đột biến tái tổ hợp.
8 chủng HBx đột biến đặc biệt phân lập từ bệnh nhân UTG và 1 chủng HBx hoang dại (wildtype) được chế tạo bằng phương pháp tách dòng (cloning) tái tổ hợp toàn bộ gene HBx trong vector pcDNA3.1 (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Germany). Quá trình tái tổ hợp được thực hiện sử dụng cặp mồi X-F1374: 5’-CCGCTCGAGATGGCTGCTAGGCTGTACTGCC-3’ và X-R1856: 5’-CCGGGGCCCGGACATGTACAAGAGATGA-3’, HBV- nt. 1–483 (HBx-ATG = nt 1). Các mồi được thiết kế có đầu 5’- mang trình tự
nt của enzyme giới hạn XhoI hoặc ApaI (trình tự nt có gạch chân) để thực hiện cloning. Các plasmid mang gene SOCS1 (suPre-Sor of cytokine signaling 1) và SOCS3 được tách dòng tái tổ hợp trong vector pcDNA3.1. Tất cả các plasmids sau khi tách dòng đều được giải trình tự gene để xác định
đúng gene, đúng kiểu đột biến và đúng chiều đã được tái tổ hợp thành công trong vector pcDNA3.1.
2.2.15.2. Biến nạp và nuôi cấy tế bào (Cell culture and transfections).
Tế bào sử dụng trong nghiên cứu này là tế bào ung thư biểu mô gan HepG2 (ATCC). Tế bào này được dùng cho tất cả các thí nghiệm đánh giá chức năng của gen HBx liên quan đến nuôi cấy tế bào. Số lượng tế bào HepG2 chuẩn bị là 2,5 x 105 tế bào cho mỗi giếng của đĩa nuôi cấy (plate) 6 giếng. Tế bào HepG2 được phát triển trong môi trường Dulbecco’s modified Eagle (Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Germany) có 10% FBS (Feltal Bovine Serum) và 1% kháng sinh streptomycine và penicilline. Chuyển plasmid vào tế bào gan (transfection) bằng phương pháp biến nạp nhanh dùng phương pháp tủa calcium phosphate DNA với HBx-plasmid. Tại thời điểm 24, 48 và
72 giờ sau biến nạp thành công HBx-plasmid vào tế bào HepG2, tế bào nuôi cấy được thu hoạch protein dùng cho các phân tích tiếp theo như đánh giá tương tác nội bào của HBx-protein với các protein truyền tín hiệu STAT1, STAT3 và NF-kB. Tất cả các thí nghiệm được thực hiện lặp lại ít nhất 03 lần, mỗi lần đều tiến hành cặp đôi song song.
2.2.15.3. Thu hoạch tế bào sau nuôi cấy
Tế bào HepG2 biến nạp HBx-plasmid sau nuôi cấy 48 giờ được rửa 2 lần bằng dung dịch PBS 1x và thu hoạch dùng l00µl dung dịch “Cell Lysis Buffer 1×” (Promega) (25 mM Tris-phosphate (pH 7,8), 2 mM DTT, 2 mM 1,2-diaminocyclohexane -N,N,N´,N´-tetraacetic acid, 10% glycerol và 1% Triton® X-100). Tế bào được ủ với dung dịch “cell lysis buffer” ở nhiệt độ
phòng 15 phút. Thu dung dịch lỏng chứa tế bào đã tan trong ống 1,5ml và ly tâm 14000 vòng/phút trong 3 phút. Chuyển protein tế bào sang một ống 1,5ml mới. Nồng độ protein toàn phần được đo bằng kỹ thuật Bradford dùng chất màu Coomassie blue G theo qui trình thường qui tại labo. Dung dịch protein của tế bào được dùng để thực hiện phản ứng luciferase ngay.
2.2.15.4. Phản ứng Luciferase xác định hoạt tính NF-kB
Tế bào HepG2 nuôi cấy ổn định sau 24 giờđược biến nạp (transfection) với các HBx-plasmid đột biến hoặc wt phối hợp cùng với NF-kB-Luc vector (luciferase reporter gene) và β-GAL vector hoặc với chứng âm là HBx- plasmid với TAL vector (vector trống) và β-GAL vector hoặc với NF-kB-Luc vector với vector trống pcDNA3.1 (vector dùng tách dòng tạo HBx-plasmid) và β-GAL vector theo tỷ lệ 1:1:1 plasmid-DNA (1µg/µl). Phương pháp biến nạp dùng tủa Calcium-Phosphate DNA. Các tế bào nuôi cấy phát triển sau 48 giờ được thu hoạch, sau đó làm tan tế bào thu protein toàn phần.
Phản ứng luciferase được tiến hành khi sử dụng kit của Promega. Qui trình theo hướng dẫn của nhà sản xuất (www.stratagene.com). Tóm tắt, 10 µl dung dịch protein mẫu được trộn với 100 µl hỗn hợp đệm phản ứng – cơ chất luciferase (luciferase substrate–assay buffer mixture) trong ống luminometer, trộn nhẹ nhàng và đặt ngay ống vào máy luminometer. Đo cường độ ánh sáng từ phản ứng khoảng 8 giây sau khi trộn dung dịch protein mẫu với cơ chất trong khoảng 5 đến 30 giây. Tất cả mẫu được thực hiện với một thời gian chờ
giống nhau. Các thí nghiệm được thực hiện lặp lại ít nhất 03 lần, mỗi lần đều tiến hành cặp đôi song song.
2.2.16. Phân tích thống kê
Các số liệu được phân tích bằng thuật toán non-parametric Mann- Whitney U-test, chi bình phương (Chi(2) test, so sánh không đối xứng T-test, so sánh 2 tỷ lệ, 2 số trung bình, tỷ suất chênh (OR), mối tương quan (RR) và
đường cong ROC bằng các phần mềm Statview, version 4.57 (www.statview.com), chương trình STATA (www.stata.com) Stata và SPSS 10. (SPSS15 Inc., Chiago, IL, USA).
Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. Đặc điểm chung các nhóm nghiên cứu
3.1.1. Đặc điểm về tuổi và giới
Bảng 3.1. Đặc điểm về giới và tuổi của các nhóm bệnh nhân nghiên cứu
Các chỉ số NMVR (1) (n=50) VGM (n=50)(2) UTG (n=90) (3) P Giới (Nam/nữ) 42/8 38/12 77/13 >0.05 Tuổi 27.3±8.3 42.5±12.3 55.1±13.2 P3-1,2<0.05 Nhận xét: Tổng số có 157/190 (82.63%) bệnh nhân nam và 33/190 (17.37%) bệnh nhân nữ. Tuy nhiên, giữa các nhóm không có sự khác biệt về
tỷ lệ nam/nữ. Tuổi ở các nhóm có sự khác biệt, trong đó tuổi cao nhất là nhóm ung thư gan. Sự khác biệt về tuổi của nhóm này với các nhóm còn lại là có ý nghĩa thống kê (P<0.05). Ký hiệu: NMVR=người mang virut viêm gan B không triệu chứng; VGM=viêm gan B mạn tính; UTG=ung thư gan.
3.1.2. Đặc điểm của một số xét nghiệm cận lâm sàng của các nhóm nghiên cứu cứu
Bảng 3.2. So sánh một số chỉ số cận lâm sàng thông thường giữa các nhóm Các chỉ số NMVR (1) (n=50) VGM (2) (n=50) UTG (3) (n=90) P HBsAg (+/-) 50/0 50/0 90/0 KPT HBeAg (+/-) 28/22 31/19 54/36 >0.05 TC (G/L) 252 ± 33 243 ± 34 107 ± 34 P3-2,1<0.01 AST (U/L) 25.44±10.2 251± 18.3 110.8±107.4 P1-2,3<0.01 P2-3<0.05 ALT (U/L) 26.5 ± 7.7 269.1±17.3 100.3±91.9 P1-2,3<0.01 P2-3<0.05 Bilirubin (µMol/L) 9.8 ± 0.9 42.1±2.9 35.4 ±15.1 P1-2,3<0.05 Protein TP (g/L) 78 ± 10 76 ± 10 72 ± 13 >0.05 Albumin (g/L) 40 ± 3 39 ± 3 35 ± 3 >0.05 Prothrombin (%) 85 ± 10 80 ± 12 72 ± 10 P3-1,2<0.05
Nhận xét: Không có khác biệt giữa các nhóm nghiên cứu về tình trạng mang kháng nguyên e và nồng độ protein toàn phần. Tiểu cầu thấp nhất ở (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
nhóm UTG, thấp hơn có ý nghĩa so với 2 nhóm còn lại (P<0.01). Nồng độ
AST,ALT tăng cao ở nhóm viêm gan mạn tính và UTG, AST/ALT bình thường ở nhóm người mang HBV mạn tính không triệu chứng. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê. Prothrombin giảm thấp ở nhóm UTG so với 2 nhóm còn lại.
3.2. Nồng độ HBV DNA trên các nhóm nghiên cứu
3.2.1. So sánh nồng độ HBV DNA trên các nhóm nghiên cứu Bảng 3.3: Nồng độ HBV DNA tại thời điểm đưa vào nghiên cứu Bảng 3.3: Nồng độ HBV DNA tại thời điểm đưa vào nghiên cứu
HBV DNA (copies/ml) Nhóm nghiên cứu Trung bình ± Độ lệch chuẩn P NMVR (1) 4.6 x 108 9.08 x 107 VGM (2) 8.1 x 108 1.5 x 108 UTG (3) 4.8 x 107 1.6 x 107 P3-1<0.01 P3-2<0.05 Nhận xét: So với 2 nhóm VGM và NMVR thì nhóm UTG có nồng độ HBV DNA thấp hơn có ý nghĩa (lần lượt là P<0.01 và P<0.05).
Hình 3.1: So sánh nồng độ HBV DNA trên các nhóm nghiên cứu tại thời điểm đưa vào nghiên cứu
Nhận xét: Nồng độ HBV DNA cao nhất ở nhóm VGM, thấp nhất ở nhóm UTG. Sự khác biệt giữa các nhóm có ý nghĩa thống kê.
3.2.2. So sánh nồng độ HBV DNA trên các nhóm tại thời điểm đưa vào nghiên cứu và thời điểm kết thúc nghiên cứu và thời điểm kết thúc
Bảng 3.4: So sánh nồng độ HBV DNA tại thời điểm đưa vào nghiên cứu và khi kết thúc nghiên cứu
HBV DNA (copies/ml) Nhóm nghiên cứu Lần 1 TB ± ĐLC Lần 2 TB ± ĐLC P NMVR (1) 4.6 x 108 ± 9.08 x 107 4.1 x 108 ± 5.07 x 107 >0.05 VGM (2) 8.1 x 108 ± 1.5 x 108 6.1 x 108 ± 3.5 x 108 >0.05 UTG (3) 4.8 x 107 ± 1.6 x 107 6.8 x 107 ± 3.6 x 107 >0.05 Kí hiệu: TB±ĐLC = số trung bình ± độ lệch chuẩn.
Hình 3.2. So sánh nồng độ HBV DNA tại thời điểm đưa vào nghiên cứu và khi kết thúc nghiên cứu.
Nhận xét: So sánh nồng độ HBV DNA tại thời điểm đưa vào nghiên cứu và thời điểm kết thúc nghiên cứu không có sự khác biệt.
3.3. Kiểu gene HBV trên các nhóm nghiên cứu
3.3.1. Phân bố kiểu gene HBV trên 190 đối tượng nghiên cứu
2.1 22.1 46.31 1.57 2.1 1.05 1.05 7.37 0.521.57 14.26 A B C D E F G A/C A/D C/D B/C
Hình 3.3. Phân bố kiểu gene trên 190 bệnh nhân nghiên cứu
Nhận xét: Trên 190 bệnh nhân có các kiểu gene đơn: A, B, C, D, E, F, G và các kiểu gene hỗn hợp: A/C, A/D, C/D, B/C. Trong đó kiểu gene C chiếm tỷ lệ cao nhất (46.3%), kiểu gene B chiếm 22.1%, kiểu gene B/C chiếm 14.26%, A/C chiếm 7.37%, còn lại các kiểu gene khác chỉ chiếm tỷ lệ
3.3.2. Phân bố kiểu gene HBV trên các nhóm nghiên cứu Bảng 3.5: Phân bố kiểu gene trên các nhóm nghiên cứu
KIỂU GENE NMVR (n=50) n (%) VGM (n=50) n (%) UTG (n=90) n (%) Tổng n (%) A 2 (4) 1 (2) 1 (1.1) 4 (2.1) B 14 (28) 16 (32) 12 (13.3) 42 (22.1) C 24 (48) 19 (38) 45 (50) 88 (46.31) D 1 (2) 1 (2) 1 (1.1) 3 (1.57) E 1 (2) 1 (2) 2 (2.2) 4 (2.1) F 1 (2) 0 (0) 1 (1.1) 2 (1.05) G 0 (0) 0 (0) 2 (2.2) 2 (1.05) A/C 1 (2) 7 (14) 6 (6.6) 14 (7.37) A/D 1 (2) (0) 0 (0) 1 (0.52) C/D 1 (2) 1 (2) 1 (1.1) 3 (1.57) B/C 4 (8) 4 (8) 19 (21.1) 27 (14.26) TỔNG 50 (100) 50 (100) 90 (100) 190 (100) Nhận xét: Tất cả có 7 kiểu gene đơn A, B, C, D, E, F, G và các kiểu gene hỗn hợp: A/C, B/C, A/D, C/D đã được xác định trên các nhóm nghiên cứu. Trong đó kiểu gene C gặp nhiều nhất với các tỷ lệ tương ứng là 50% trên nhóm UTG, 48% trên nhóm NMVR và 38% trên nhóm VGM. Sự khác
gene C có cả trong các bệnh nhân mang hơn 1 kiểu gene thì chúng ta thấy tỷ
lệ bệnh nhân mang kiểu gene C ở các nhóm: NMVR là 30/50 (60%), VGM là 31 (62%) và UTG là 71/90 (78.88%). Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với P<0.05. Tổng số bệnh nhân có hơn 1 kiểu gene trên các nhóm lần lượt là: NMVR: 7/50 (14%), VGM: 12/50 (24%) và UTG: 26/90 (28.88%). Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa nhóm NMVR và UTG (14% so với 28.88%, P<0.05), trong khi đó giữa các nhóm NMVR và VGM cũng như VGM với UTG không có sự khác biệt về tỷ lệ nhiễm hơn một kiểu gene.
3.3.3. Mối liên quan giữa kiểu gene với mức độ tổn thương gan tại thời điểm đưa vào nghiên cứu
Do tỷ lệ bệnh nhân mang kiểu gene C là chủ yếu, còn các kiểu gene khác chỉ xuất hiện với số lượng ít, kiểu gene C lại xuất hiện trên nhóm UTG nhiều hơn nên chúng tôi so sánh 2 nhóm: kiểu gene C và nhóm các kiểu gene còn lại (gọi là kiểu gene không C) trên bệnh nhân ung thư gan.
3.3.3.1. Mối liên quan giữa kiểu gene C và không C với hoạt độ enzyme AST trên bệnh nhân ung thư gan
Hình 3.4. So sánh hoạt độ enzyme AST trên nhóm bệnh nhân UTG có kiểu gene C và không C
Nhận xét: So với kiểu gene không C thì kiểu gene C trên nhóm bệnh nhân UTG có hoạt độ enzyme AST cao hơn có ý nghĩa (115.8±95.4 so với 75.8±45.4, P<0.01).
3.3.3.2. Mối liên quan giữa kiểu gene C và không C với hoạt độ enzyme ALT trên bệnh nhân ung thư gan
Hình 3.5. So sánh hoạt độ enzyme ALT trên nhóm bệnh nhân UTG có kiểu gene C và không C
Nhận xét: Tương tự như AST, hoạt độ enzyme ALT cũng tăng cao hơn trên nhóm bệnh nhân UTG có kiểu gene C so với bệnh nhân mang kiểu gene không C (120.8±85.4 so với 85.8±55.4, P<0.05).
3.3.3.3. Mối liên quan giữa kiểu gene HBV với mức độ nhân lên của virut (HBV DNA) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 3.6. So sánh nồng độ HBV DNA trên bệnh nhân UTG có kiểu gene C với kiểu gene không C
Nhận xét: So với kiểu gene C thì bệnh nhân UTG có kiểu gene không C có nồng độ HBV DNA thấp hơn có ý nghĩa (5.1 x 108 ± 2.5 x 108 so với 6.7 x 107 ± 4.6 x 107, P <0.01).
3.4. Đột biến gene Pre S
3.4.1. Các loại đột biến gene Pre S được tìm thấy
Để đảm bảo kết quả giải trình tự là chính xác chúng tôi đã tiến hành giải trình tự vùng Pre-S bằng cả mồi xuôi và mồi ngược, dùng phần mềm
CEQ 8800 và Bioedit để xác định chính xác chuỗi trình tự giải được. Kết quả
một số ví dụ minh họa được trình bày ở trong các hình và các bảng sau:
Hình 3.7. Kết quả phân tích gene phát hiện đột biến mất đoạn Pre-S