Về nguyên lý và các bước tiến hành của việc giải trình tự gene pre-Core cũng tương tự như giải trình tựđoạn gene Pre-S. Điểm khác là trình tự mồi và chu trình nhiệt:
Trình tự mồi:
HBV_pre Core F: 5’-TACACCTCCTTTCCATGGCTGCT-3’ HBV_pre Core R: 5’-CCTGAGTGCTGTATGGTGAGG-3’ Chu trình nhiệt: 950C --- 5 phút 940C ---30 giây 550C --- 30 giây 45 chu kỳ 720C --- 45 giây 720C --- 5 phút 40C --- ∞ 2.2.6. Giải trình tự gene HBX
Về nguyên lý và các bước tiến hành của việc giải trình tự gene HBX cũng tương tự như giải trình tựđoạn gene Pre-S. Điểm khác là trình tự mồi và chu trình nhiệt:
Trình tự mồi:
HBV_1369 F: 5’-TTTCCATGGCTGCTAGGCTGTACT-3’ HBV_1961R: 5’-AAGGCAAAAACGAGAGTAACTCC-3’
Chu trình nhiệt: 950C --- 5 phút 940C ---30 giây 580C --- 30 giây 40 chu kỳ 720C --- 45 giây 720C --- 5 phút 40C --- ∞
2.2.7. Giải trình tự gene vùng khởi động nhân
Về nguyên lý và các bước tiến hành của việc giải trình tự gene vùng khởi động nhân cũng tương tự như giải trình tự đoạn gene Pre-S. Điểm khác là trình tự mồi và chu trình nhiệt: Trình tự mồi: BCP F: 5’-CTGTCGTCCTCTCGCGGAAAT-3’ BCP R: 5’-CTCCACAGTAGCTCCAAATTCT-3’ Chu trình nhiệt: 950C --- 5 phút 940C ---30 giây 560C --- 30 giây 45 chu kỳ 720C --- 45 giây 720C --- 5 phút 40C --- ∞
2.2.8. Phương pháp xác định đột biến gene P53
Về nguyên lý và các bước tiến hành của việc giải trình tự gene P53 cũng tương tự như giải trình tựđoạn gene Pre-S. Điểm khác là trình tự mồi và chu trình nhiệt:
Trình tự mồi: P53 F1: 5’-CTTGCCACAGGTCTCCCCAA-3’, P53 R1: 5’-AGGGGTCAGCGGCAAGCAGA-3’ Khi các mẫu khó nhân lên chúng tôi sử dụng bộ mồi sau:
P53 F2: 5’-AGGCGCACTGGCCTCATCTT-3’ P53 R2: 5’- TGTGCAGGGTGGCAAGTGGC-3’ Chu trình nhiệt: 950C --- 5 phút 940C ---30 giây 600C --- 30 giây 40 chu kỳ 720C --- 30 giây 720C --- 5 phút 40C --- ∞
2.2.9. Phương pháp xác định đột biến gene mã hóa thụ thể IFN (IFN R)
Để khảo sát đột biến gene INFAR1 tại điểm 17470 (G→C) chúng tôi sử dụng các cặp mồi: 5’-CTTTCCCTGTAGTAGTGGTTCT-3’ (IFNAR-F1) và 5’-CTGTAGTGAGCCGTGATTGT-3’ (IFNAR-R1), (Qiagen,
Germany).
Sản phẩm tạo ra có kích thước 420-base pair (bp). Phản ứng được tiến hành trong 50 µL chứa Taq DNA polymerase (0.5 units); 0.2 µM của mỗi mồi; 2.5 mM MgCl2; 2 µM 0.4 µL dNTP và H2O vừa đủ.
Chu trình nhiệt: 950C --- 5 phút 950C ---30 giây 600C --- 30 giây 35 chu kỳ 720C --- 30 giây 720C ---10 phút 40C --- ∞
Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng chạy điện di trên thạch agarose. Tiếp theo tiến hành các phản ứng cắt enzyme theo phương pháp PCR RFLP sử dụng enzyme BsmAI ủở 55oC trong 1 giờ (New England Biolabs). BsmAI cắt sản phẩm PCR từ 420 bp thành 2 mảnh 359bp và 61bp. Sau khi cắt enzyme sẽ kiểm tra bằng chạy điện di trên thạch 3% nhuộm Ethidium bromide và soi dưới kính có đèn cực tím.
Để phân tích gene IFNAR1 tại vị trí Leu168Val chúng tôi sử dụng cặp mồi: 5’-AGCTTTCTATCCTATCTGTATG- 3’ (IFNAR-F2) và 5’-TTCGCC TAATTTTTCTCT-3’ (IFNAR-R2). Quy trình phản ứng giống như mô tả
trên, ngoại trừ nhiệt độ gắn mồi có khác là 54oC trong 30 giây. Sản phẩm PCR có kích thước là 345 bp. Sau đó được cắt bằng enzyme DdeI theo hướng dẫn của nhà sản xuất (New England Biolabs). Sản phẩm tạo ra là 3 đoạn có kích thước 60bp, 78bp và 207bp. Nếu có đột biến thì sẽ cho 2 đoạn có kích thước 86bp và 121bp.
2.2.10. Định lượng nồng độ HBX trong huyết tương
Nồng độ kháng nguyên HBX được định lượng bằng phương pháp SANDWICH ELISA. Lợi thế của phương pháp này là không cần làm sạch mẫu trước khi đưa vào định lượng, độ nhạy cao hơn 2-5 lần so với phương pháp ELISA trực tiếp và gián tiếp.
Quy trình được thực hiện như sau:
Bước 1: Phủ kháng nguyên
1. Pha loãng kháng nguyên (huyết tương)trong đệm carbonate/bicarbonate buffer (pH7.4) với nồng độ cuối cùng là 20µg/ml. Phủ 100µl huyết thanh bệnh nhân hoặc các mẫu chuẩn lên các giếng. Mỗi mẫu huyết tương hoặc mẫu chuẩn được chạy trên 2 giếng.
2. Đậy nắp giếng bằng tấm plastic và ủ qua đêm ở 4°C.
3. Loại bỏ dung dịch ủ hôm trước và rửa các giếng 3 lần bằng 200 µl PBS.
Bước 2: Cốđịnh mẫu:
4. Phủ các vị trí gắn protein còn lại bằng 200 µl blocking buffer, 5% non fat dry milk/PBS mỗi giếng
5. Đậy nắp các giếng bằng tấm nhựa plastic và ủ ở nhiệt độ phòng 1-2 giờ
hoặc qua đêm ở nhiệt độ 4°C.
6. Rửa toàn bộ các giếng 2 lần bằng PBS
Bước 3: Ủ với kháng thểđầu tiên ab235 và kháng thể thứ hai ab6728:
7. Thêm 100 µl kháng thể ab235 phát hiện cho mỗi giếng.
8. Đậy các giếng bằng tấm nhựa plastic và ủở nhiệt độ 40C qua đêm 9 Rửa 4 lần bằng 200 µl PBS PBS.
10. Thêm 100 µl kháng thể thứ 2 – ab6728 – đã được pha loãng ở nồng độ tối
ưu trong buffer cốđịnh
11. Đậy các giếng bằng tấm nhựa plastic và ủ 1-2 h ở nhiệt độ phòng. 12. Rửa các giếng 4-5 lần bằng 200 µl PBS.
Các kháng thể , hóa chất đã được pha loãng theo khuyến cáo của abcam (Mỹ).
Bước 4: Phát hiện:
14. Trộn đều 100 µl HRP chromogenes cho các giếng.
15. Dùng cơ chất 100 µl TMB (3,3’,5,5’-tetramethylbenzidinine ) ủ 15 phút và thêm 100 µl H2SO4 và đọc mật độ quang ở 450nm.
Bước 5: Phân tích kết quả:
Dựa vào các chứng dương với nồng độ kháng nguyên HBx đã biết và các chứng âm. Kết quả thu được so sánh mẫu phân tích (của bệnh nhân) chưa biết so với chứng dương đã biết suy ra nồng độ trong mẫu hoặc kết quả là dương tính hay âm tính. Giá trị của các mẫu được tính bằng số trung bình cộng của 2 giếng.
2.2.11. Định lượng AFP mRNA
Máu tĩnh mạch của bệnh nhân được lấy vào hai thời điểm: ngay khi tham gia nghiên cứu và tháng thứ 18 theo dõi. Các mẫu máu được giữ trong các ống chống đông chứa sẵn EDTA. Các tế bào đơn nhân máu ngoại vi được thu lại bằng ly tâm gradient trọng lực Ficoll-Hypaque.
- Tách chiết RNA và tổng hợp cDNA: RNA tổng số được tách từ các tế bào
đơn nhân máu ngoại vi bằng phương pháp Trizol Reagent (Invitrogen, Mỹ) theo quy trình của nhà sản xuất. Chất lượng và khối lượng RNA được đánh giá bằng điện di trên máy Agilent. Phản ứng phiên mã ngược tổng hợp cDNA
được tiến hành bằng kit tổng hợp cDNA (Invitrogen, Mỹ) theo quy trình của nhà sản xuất. cDNA được giữở -200C cho nghiên cứu tiếp theo.
- Định lượng AFP mRNA: Định lượng mRNA của gene mã hóa AFP đặc hiệu ung thư gan được tiến hành bằng định lượng tương đối (Relative Quantification) với Real-time PCR. Để kiểm soát độ chính xác của phương pháp cũng như lượng mRNA đưa vào ban đầu trong các mẫu của phản ứng real-time PCR, ngoài việc định lượng mRNA của gen AFP chúng tôi định lượng song song cả “housekeeping gene” β-actin. Nguyên lý sử dụng là định lượng tương đối bằng Real-time PCR sử dụng TaqMan probe (Pfaffl, 2001).
Các mồi và probe sử dụng trong nghiên cứu có trình tự như sau:
Tên Trình tự
AFP forward primer 5’-TGAAGAGGGAAGACATAACTG-3’ AFP reversed primer 5’-AGCAGCCCAAAGAAGAAT-3’
AFP TaqMan Probe 5’-FAM-ACACAAAAAGCCCACTCCAGC-TAMRA-3’
β-actin forward primer 5’-GATGGCCACGGCTGCTT-3’
β-actin reversed primer 5’-ACCCTCATTGCCAATGGT-3’
β-actin TaqMan Probe 5’-VIC-CTACGAGCTGCCTGACGGCCAGG-TAMRA-3’
Phản ứng PCR được tiến hành trên hệ thống LightCycler 2.0 (Roche), khuếch đại đồng thời cả HS AFP-mARN và β-actin mARN trong cùng một
ống phản ứng sử dụng 5µl cDNA, 1 µl mồi và probe mỗi loại, 4 µl Master Mix trong tổng thể tích phản ứng là 20 µl. Phản ứng tiến hành theo quy trình PCR hai bước: bước 1: biến tính cDNA (950C trong 5 phút); bước 2: 40 chu kỳ lặp lại (950C trong 30 giây, 660C trong 1 phút). Dữ liệu được phân tích bằng phần mềm LightCycler 4.0 (Roche). Sau khi định lượng đồng thời cả
AFP mRNA và β-actin thì sẽ phân tích kết quả dự trên tỷ lệ sau trên từng bệnh nhân: Lượng AFP-mARN trong mẫu/Lượng β-actin-mARN trong mẫu. Tỉ lệ này thể hiện mức độ biểu hiện AFP-mARN trong mẫu và qua đó phản ánh sự có mặt của các tế bào u gan đang lưu hành trong máu ngoại vi.
2.2.12. Định lượng mRNA GP73
Mức độ biểu hiện gen mRNA GP73 được đánh giá bằng việc sử dụng phương pháp Real Time PCR SYBR Green (Applied Biosystems, Mỹ). RNA tổng số được tách từ máu theo hướng dẫn của nhà sản xuất bằng QIAamp RNA blood Mini Kit (Qiagen, Mỹ). RNA tổng số sau khi được tách sẽ được
sử dụng để thực hiện phản ứng phiên mã ngược RT-PCR bằng M-MLV Reverse Transcriptase (Promega, Mỹ). Sản phẩm cDNA sau đó được cất ở tủ
-20oC cho đến khi định lượng bằng Real Time PCR.
Để xác định mức độ biểu hiện của GP73, chúng tôi sử dụng phương pháp so sánh nội chuẩn từng cặp gene chạy đồng thời GP-73 và GAPDH. Nguyên lý là do khi tách chiết RNA của từng mẫu sẽ không giống nhau, vì ở
các thời điểm khác nhau do đó nếu không có gene nội chuẩn để so sánh thì sẽ
cho kết quả không chính xác. Gene nội chuẩn GAPDH là một gene luôn biểu hiện ổn định trong tất cả các mô, tế bào, do đó người ta thường sử dụng gene này để so sánh đối chứng. Các cặp mồi được sử dụng trong nghiên cứu này là:
GP73-F: 5’-CAGCGCTGATTTTGAGATGA-3’
GP73-R: 5’-ATGATCCGTGTCTGGAGGTC-3’ cho gene GP-73. Mồi cho gene nội chuẩn GAPDH:
GAPDH – F: 5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3’ GAPDH – R: 5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’ Thành phần phản ứng Real time PCR:
Thành phần phản ứng Thể tích
2X SYBR Green PCR master mix 25 µl
Mồi – F 1.25 µl
Mồi – R 1.25 µl
Sản phẩm cDNA 5 µl
H2O 17.5 µl
Phản ứng tiến hành theo chu trình nhiệt được thiết lập trên hệ thống máy Real-time ABI 7500: 95oC – 10 phút; 45 chu kỳ (95oC – 15 giây, 60oC – 1 phút).
Mức độ biểu hiện mRNA GP73 được xác định dựa trên việc so sánh
đánh giá cường độ của các tín hiệu huỳnh quang và nội chuẩn GAPDH. Cụ
thể là tính toán tỷ lệ chu kỳ (Ct) giữa GAPDH và GP-73.
2.2.13. Định lượng DNA lưu hành tự do trong huyết tương (GSTP1)
GSTP1 đã được định lượng trong huyết tương bằng công nghệ Real Time PCR trên hệ thống máy Real time – PCR ABI 7500 (Applied BioSystem, Mỹ). Quy trình tóm tắt như sau: huyết tương của bệnh nhân được thu hồi sau khi lấy máu toàn bộ 4 giờ. DNA tổng số được tách chiết bằng Kit Qiagen theo quy trình của nhà sản xuất. cfDNA (GSTP1) được nhân lên bằng cặp mồi: SGTP1 F: 5’-ACC CCA GGG CTC TAT GGG AA-3’ và SGTP1 R: 5’-TGA GGG CAC AAG AAG CCC CT-3’. Và được nhận biết bằng Prob theo trình tự sau: SGTP1 Probe: FAM-GAC ATG GTG AAT GAC GGC GTG T-TAMRA. Nguyên lý sử dụng các mẫu dò (Probe) theo phương pháp Taqman. Đây là phương pháp đặc hiệu nhất hiện nay so với các phương pháp sử dụng trong Real Time PCR khác. Bình thường chất TAMRA sẽ ức chế sự
phát sáng của chất FAM. Khi có đoạn DNA đặc hiệu với probe thì probe sẽ
gắn vào và đoạn TAMRA sẽ tách ra và giải phóng FAM, do đó FAM phát sáng và máy sẽ đo cường độ ánh sáng mà biết chính xác số copies có trong mẫu theo thời gian.
2.2.14. Phương pháp hóa mô miễn dịch
Nguyên lý của phương pháp Hóa mô miễn dịch là sử dụng kháng thể đặc hiệu để phát hiện kháng nguyên trên bề mặt mô. Phức hợp gắn kết kháng
Bước 1: Cốđịnh mô và bảo quản trong Paraffin Bước 2: Cắt bệnh phẩm
Bước 3: Loại bỏ Paraffin và nước Bước 4: Phục hồi kháng nguyên Bước 5: Nhuộm hóa mô miễn dịch
Bước 6: Loại bỏ nước và bình ổn bằng dung môi Bước 7: Kiểm tra kết quả nhuộm dưới kính hiển vi Cụ thể các bước được tiến hành như sau:
¾ Nguyên vật liệu và hóa chất
- Xylene
- Ethanol, anhydrous denatured, histological grade (100% và 95%) - Deionized water (dH2O)
- Hematoxylin
- Wash Buffer: 1X TBS/0.1% Tween-20 (1X TBST), 10X Tris Buffered Saline (TBS).
- TBST/5% normal goat serum
- PBST/5%: 1X PBS/0.1% Tween-20 (1X PBST); 10X Phosphate Buffered Saline (PBS).
- Antigen Unmasking: Citrate, EDTA, TE, Pepsin. - 3% Hydrogen Peroxide.
- Blocking Solution.
- Biotinylated secondary antibody. - ABC Reagent. - DAB Reagent. ¾ Loại bỏ Paraffin và nước - Ủ mảnh tổ chức 3 lần, mỗi lần 5 phút trong Xylene. - Ủ mảnh tổ chức 2 lần, mỗi lần 10 phút trong cồn 100%. - Ủ mảnh tổ chức 2 lần, mỗi lần 10 phút trong cồn 95%.
- Rửa 2 lần với nước sạch, mỗi lần trong 5 phút.
¾ Bộc lộ kháng nguyên
- Đun sôi slide trong dung dịch sodium citrate 10 mM, pH 6.0 sau đó duy trì ở nhiệt độ gần sôi khoảng 10 phút, làm lạnh slide trong 30 phút.
¾ Nhuộm
- Rửa 3 lần, mỗi lần 5 phút bằng nước sạch - Ủ hydrogen peroxide 3% trong 10 phút - Rửa 2 lần, mỗi lần 5 phút bằng nước sạch - Rửa 5 phút bằng dung dịch rửa
- Thêm 100-400 µl blocking solution trong 1 giờ ở nhiệt độ phòng
- Loại bỏ dung dịch block và thêm 100-400 µl kháng thể đầu (primary antibody), ủ qua đêm ở 4°C
- Loại bỏ kháng thể và rửa 3 lần, mỗi lần 5 phút bằng dung dịch rửa - Thêm 100-400 µl biotinylated secondary antibody. Ủ 30 phút ở nhiệt
độ phòng
- Chuẩn bị dung dịch ABC và ủở nhiệt độ phòng 30 phút
- Loại bỏ kháng thể thứ 2 và rửa 3 lần, mỗi lần 5 phút bằng dung dịch rửa
- Thêm 100-400 µl ABC và ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng
- Loại bỏ dung dịch ABC và rửa 3 lần, mỗi lần 5 phút bằng dung dịch rửa
- Thêm 100-400 µl DAB và theo dõi sự chuyển màu - Ngay khi có chuyển màu thì nhúng slide vào trong nước - Rửa bằng nước sạch 2 lần, mỗi lần 5 phút
¾ Loại bỏ nước
- Ủ trong cồn 95% 2 lần, mỗi lần 10 giây - Ủ trong cồn 100% 2 lần, mỗi lần 10 giây
- Phủ slide
2.2.15. Phương pháp nghiên cứu chức năng của đột biến gen HBx phân lập từ bệnh nhân UTG
2.2.15.1. Chế tạo các plasmid HBx đột biến tái tổ hợp.
8 chủng HBx đột biến đặc biệt phân lập từ bệnh nhân UTG và 1 chủng HBx hoang dại (wildtype) được chế tạo bằng phương pháp tách dòng